A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optimering av renal organoid och organotypisk kultur för vascularization, utökad utveckling och förbättrad mikroskopi Imaging
Chapters
Summary March 28th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta arbete beskriver två metoder för att studera organutveckling, en förbättrad xenotransplantation setup på chorioallantoic membran (CAM) från aviära embryon som möjliggör vascularization av odlade embryonala organ och organoider och en ny fast z-riktning organodlingsmetod med modifierade experimentella tillstånd som möjliggör högupplösning av time-lapse confocal imaging.
Transcript
Njurorganskultur och organeller som härrör från programmerade stamceller ger utmärkta sätt att studera mekanismer bakom njurutveckling och sjukdom. Det nuvarande organkultursystemet ger dock inte blodflödet till njuren. På grund av detta, anledning de nuvarande modellerna är ofullständiga och misslyckas med att rekapitulera njurens huvudfunktion, vilket är blodfiltrering.
I denna publikation presenterar vi ett förbättrat protokoll för odling och visualisering av embryo njurar och organoider på chorioallantoic membranet av kyckling embryo. I vår roman experimentella inrättas, överlagrar vi njuren rudiments transplanteras på CAM med genomsläpplig mening reservoarer som är fyllda med kultur medium. Detta protokoll ökar signifikant överlevnaden av njure rudiment och även de inneboende endotelceller.
Metoden möjliggör blodflöde till de utvecklande glomerulus. Nyligen publicerade vi också en ny fast uppsättning riktning orgel kultur metod som erbjuder högupplösta confocal 3D time-lapse imaging. Metoden gav optimala förutsättningar för långsiktig confocal avbildning av organoiderna och orgelrudiments.
I tillvägagångssättet komprimerar vi försiktigt vävnaden mellan ett glaslockssli och ett genomsläppligt membran. Här visar vi hur de specialdesignade plattorna är gjorda och hur kulturexperimenten sätts upp. Således, i denna publikation presenterar vi en förbättrad renal organelle slangar kultur teknik.
Denna metod erbjuder ett bättre sätt att modellera organell genesis och genomföra högupplösta imaging att studera embryonala njurar och njurorganoider ex vivo. Beroende på ditt experiment ta överföring cell contra-skär avsedda för sex-väl eller 12-brunn plattor. Skär ner sidorna av skäret med hjälp av ett Dremel-verktyg för att skapa en två millimeter hög plastring med ett genomsläppligt membran fäst vid den.
Polera kanterna på ringen från swarf med en skalpell eller en vass kniv. Sterilisera minireservoarerna i 70%etanol i minst en timme. Tvätta sedan minireservoarerna i autoklav genom destillerat vatten och torka dem i en laminär huva.
Skölj minireservoarerna i PBS och odlingsmedium. Placera reservoaren på en petriskål ovanpå vår droppe odlingsmedium med membranet uppåt. Ordna dissekerade ex vivo embryonala njurar eller njurorganoider på membranet.
Undvik att lämna mycket vätska runt proverna och lämna dem bifogade från två till 24 timmar i en cellkultur inkubator. Exenal transplantation görs till chorioallantoic membranet av åtta dagar gamla ex ovo embryonal kyckling. Överför minireservoarerna så att membranet täcker transplantatet.
Placera dem i CAM:s periferi så att de inte täcker embryot. Lägg sedan till odlingsmedium till minireservoarerna. Odla proverna på kyckling CAM i nio dagar som maximum.
Byt ut odlingsmediet i minireservoarerna dagligen. Vascularization av proverna kan observeras redan 24 till 48 timmar efter transplantation. För att göra den specialdesignade sex-brunnsplåtar för den fasta kulturen.
Du måste börja med att borra 20 millimeters hål i botten av plattan med hjälp av en borrmaskin med en lämplig borrkrona. Därefter polerar hålens fälgar på plattans övre sida. Slutligen sterilisera plattorna i 70%etanol i minst en timme.
Tvätta sedan plattorna i autoklav genom destillerat vatten och torka dem i lemiar huva. Tvätta 22x22 millimeters luckan glider i 70%etanol och låt dem torka helt. Lim locket glida ovanpå ett hål i botten av en brunn med hjälp av vävnad lim.
Efter torkning, inspektera plattorna under sterilt mikroskop och ta bort det överflödiga limmet. För det första, blanda en alikvot av polystyrenpärlor med en lika stor volym väte. Placera transfillinsatsen under ett dissekerande mikroskop med membran uppåt och ordna njurarna på membranet.
Tillsätt en droppe hydro-gel pärla blandning nästa njurarna noggrant. Vänd på transfillinsatsen så att membranet och njurarna är vända nedåt. Placera sedan försiktigt insatsen i vår väl av specialdesignad sex-brunnsplatta.
Tryck insatsen mycket försiktigt i brunnen. Följ graden av den platta från mikroskopet tills njuren är i nivå med pärlorna. Håll insatsen lätt pressad till brunnen med en hand och fixera den i plattan genom att smälta plast på tre punkter i skärets periferi med ett lödkolv.
Tillsätt två milliliter odlingsmedium i brunnen genom en öppning på sidan. Vid start av en avbildning för timelapse- förflutit, för över plattan till inkubatorn på scenen av ett inverterat mikroskop. Vårt modifierade CAM capture-protokoll möjliggör mycket effektiv vaskularisering av njurorganoider och embryonala njurar.
Många reservoarer som innehåller odlingsmedium levererar donatorvävnad och skyddar den från att torka under den inledande tidsperioden som fortsätter vascularizatonen. Denna film visar flödet av kyckling blodkroppar i en embryonal mus njure centrum ympade till kyckling CAM och odlade i sju dagar. Denna figur panel visar att vår förbättrade CAM kultur metod ger tillåtande villkor för de njurmedicinska härledda endotelceller.
Siffror A och B visar embryonala njurar odlas i fem dagar på dagar intervall kultur var centrum ympade till kyckling CAM i fem dagar. Färgning med mus detaljerna CD-31 antikroppar visar att endotelcellsnätverket av njure centrum ympade till CAM är mer omfattande än i den vänstra sidan kontroll. I figuren C ser vi att mus blodkärl färgas med mus specifika CD-31 antikroppar och det är mest med kyckling blodkärl.
Figurerna D och E visar kryosektioner av mus embryonala njurar odlas på resor kultur eller kyckling CAM i fem dagar och färgas med CD-31 och Hoechst. Den glomeruli vasculature är mer mogen i njurar odlade på kyckling CAM än i kontroll kulturer. Figur F visar en mus embryonala njure odlade på CAM av en transgen GFP kyckling i sju dagar.
Musen endotelceller färgas med CD-31 antikroppar och vi kan konstatera att vasculature i xenotransplanted mus njurar är mestadels men inte uteslutande mus härledd. Den fasta uppsättningen för romanen som riktningskulturen möjliggör culturing av embryonala njurar och organoids i en inskränkt uppsättning distanserar. I en traditionell resekultur placeras de odlade organen på ett filter som hålls i ett luftmedelsgränssnitt av ett metallgaller.
Denna metod möjliggör goda förutsättningar för utveckling och tillväxt men är inte optimal för bildframställning. I den fasta inställda riktningskulturen pressas det odlade organet mellan en glasbotten av skålen och ett membran och tjockleken på den styrs av polystyrenpärlorna som arbetar som distanser här. De utvecklande organen kan avbildas rakt igenom täckglaset vilket ger den förbättrade synen på orgeln.
Denna figur panel visar att de embryonala njurarna och njure organoider kan odlas i den fasta uppsättning riktning kulturmetod. Ljusa fältbilder av embryonala njurar och njure organoider på dag sju visar normal utveckling. I figuren C har GFB-uttryck aktiverats i utvecklande nefroner av en njure organoid av figur D visar en njure med trauma en färgning på den euretric knoppen och sex två färgning märkning nephron prekursorceller.
Figurerna E och F presenterar musjure odlade i 12 dagar. Traumat en och nephron färgning visar eurethric knopp och podocites. Filmen också, presenterar en embryonal njure av MTMG, Taiwan cree ursprung, där Taiwan cree inducerar GFB uttryck i endotelceller.
Vi kan se att de njuradotelcellerna finns i den utvecklande embryonala njuren och det endotelnätverk kan också utvecklas i odlingsmetoden. I panelen till höger kan du se hur endotelceller migrerar in i kärlklyftan på ett S-format stadiumnefronet. Här har vi lagt fram det förbättrade protokollet för xenotransplantation av njurorganoider och embryonala njurar till kyckling CAM.
Detta protokoll ökar signifikant överlevnaden av njure rudiments och även deras inneboende endotelceller. Metoden möjliggör blodflöde till de utvecklande glomerulus. Det andra protokollet som presenteras här är den fasta uppsättnings riktning orgel kultur metod som förbättrar bildkvaliteten och hjälper till att studera organell genesis på encellsnivå.
De högupplösta bilderna är lämpliga för automatiserad cellsegmentering och datorbaserad studie av cellulärt beteende i njurorganoider och njurkulturer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
