Immunology and Infection
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Quantifier les particules humaines de norovirus ressemblant à un virus se liant aux bactéries commensales utilisant la cytométrie des débits
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Summary April 29th, 2020
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L’objectif de ce protocole est de quantifier la liaison du norovirus humain d’agent pathogène eucaryote aux bactéries. Après avoir effectué un premier essai d’attachement de virus-bactérie, la cytométrie d’écoulement est employée pour détecter des bactéries virales-liées dans la population.
Transcript
Les interactions virus-bactéries peuvent être importantes pour une infection virale réussie et la stimulation d’une réponse immunitaire de l’hôte. Mais actuellement, le stock hautement concentré et purifié de norovirus humain ne peut pas être produit en laboratoire. Cette technique peut être utilisée avec n’importe quel virus qui se lie à des bactéries, pour lesquelles des particules virales ou des virus vivants sont disponibles.
Il nous permet de quantifier les interactions entre ces virus et bactéries. Inoculer cinq millilitres de milieu liquide avec une seule colonie isolée d’Enterobacter cloacae à partir d’une plaque d’agar directement à partir du stock congelé de glycérol. Faire croître les bactéries du jour au lendemain.
Le lendemain, transférez 1,3 millilitre aliquots de la culture en deux tubes de centrifugeuse distincts de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant cinq minutes. Retirer les supernatants, puis laver les échantillons deux fois à l’aide d’un millilitre de 1X PBS stérile pour chaque lavage.
Centrifugez les échantillons à nouveau à 10 000 x g pendant cinq minutes. Retirer le supernatant et réutiliser la pastille en 1,3 millilitres de 1X PBS stérile. En commençant par 0,5 millilitres de culture lavée, diluer périodiquement les bactéries en 1X PBS de 10 à moins un à 10 à moins quatre.
À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de la culture non diluée lavée et chacune des quatre dilutions à 600 nanomètres. Effectuez des dilutions sérielle 10 fois en 1X PBS pour chacune des dilutions précédentes. Étendre 100 microlitres des trois dernières dilutions pour chaque série sur les plaques d’agar afin de déterminer le nombre d’unités de formation de colonies par millilitre pour chaque échantillon.
Laisser sécher les assiettes à température ambiante pendant cinq minutes. Inverser les assiettes et les incuber dans l’incubateur. Après avoir préparé les réagenouillements, les anticorps et les bactéries tels que décrits dans le manuscrit, assemblez tous les matériaux dans une armoire de biosécurité BSL-2.
Les particules virales pour le norovirus humain sont répertoriées comme pathogènes BSL-2 et tous les travaux effectués à l’aide du VLP devraient être effectués dans une armoire de biosécurité certifiée. Ajouter 10 microgrammes de VLP de norovirus humains à chaque tube de bactéries et bien mélanger par pipetting. Incuber les tubes pendant une heure à 37 degrés Celsius avec rotation constante.
Après incubation, centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant cinq minutes. Aspirer et jeter le supernatant et résusquer la pastille bactérienne en un millilitre de PBS. Après avoir répété les étapes de lavage une fois, centrifugez les tubes à nouveau à 10 000 X g pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez la pastille VLP-bactéries dans 150 microlitres de tampon de blocage de 5%. Une erreur courante qui se produit est que les tubes sont échangés et le mauvais traitement est ajouté. Pour éviter cela, disposer tous les tubes en lignes qui correspondent au traitement correct et ajouter un traitement tout à la fois aux tubes.
Pour chaque échantillon bactérien, préparez 50 microlitres d’anticorps GII à norovirus humain dilué. À l’aide d’un tampon bloquant de 5 %, diluer l’anticorps de un à 125 pour les échantillons d’E.cloacae. Préparez 50 microlitres d’anticorps isotype dilué pour chaque échantillon bactérien en utilisant les mêmes ratios de dilution.
Divisez chaque échantillon d’analyse d’attachement en 350 aliquots de microlitres en les transférant dans des tubes de centrifugeuse propres de 1,5 millilitre. Pour créer des commandes non tachées, ajouter 50 microlitres de tampon de blocage au premier aliquot de chaque échantillon bactérien. Pour les échantillons tachés, ajouter 50 microlitres de la dilution des anticorps GII à la deuxième série d’aliquots.
Créez les commandes d’isotype en ajoutant 50 microlitres de l’anticorps dilué d’isotype au troisième ensemble d’aliquots. Incuber tous les échantillons sur la glace et dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez tous les échantillons à 10 000 X g pendant cinq minutes.
Jetez les supernatants et resuspendez chaque échantillon dans 150 microlitres de FCSB. Encore une fois, centrifugez tous les échantillons à 10 000 X g pendant cinq minutes. Encore une fois, jetez les supernatants et resuspendez les échantillons dans 100 microlitres de FCSB.
Après avoir centrifugé les échantillons une dernière fois et jeté les supernatants, resuspendez les échantillons dans 150 microlitres de FCSB. Transférer chaque échantillon dans un tube contenant 400 microlitres de FCSB pour un volume total de 550 microlitres. Stockez les échantillons à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient analysés par cytométrie d’écoulement.
L’attachement de VLP a été mesuré utilisant la cytométrie de flux. Tout d’abord, des parcelles de densité ont été utilisées pour éliminer les débris cellulaires, suivies d’une parcelle à points subséquente pour éliminer les doublets bactériens et les touffes cellulaires. Les histogrammes représentatifs démontrent un manque de signal pe dans les échantillons bactériens seulement et un changement dans l’intensité de signal de PE dans des échantillons de VLP:bactérie comparés aux contrôles non tachés et d’isotype.
Après une heure d’incubation avec 10 microgrammes de VLP, la cytométrie d’écoulement a détecté la liaison de particule à E.colacae et à L.gasseri. Pour déterminer la limite de quantification contraignante pour cet essai, une série de dilution des ALV a été générée avant l’ajout à la bactérie. La réduction de la quantité de VLP a entraîné des réductions correspondantes des bactéries en pourcentage liées par VLP.
Il est important de connaître le rapport virus/bactérie et de maintenir le rapport cohérent entre les expériences dans l’interprétation des résultats. Des mutants bactériens et viraux peuvent être générés pour déterminer spécifiquement les structures de surface microbiennes qui médient cette interaction. Cette technique permet aux chercheurs de répondre à des questions concernant les circonstances et les conditions qui ont un impact sur les interactions norovirus-bactériennes, y compris la façon dont les changements dans le génotype du virus, les conditions de croissance bactérienne et les changements dans les structures bactériennes de surface modifient la liaison virale.
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