Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifiera Human Norovirus Virus-liknande partiklar bindning till commensal bakterier med hjälp av flow cytometri
Chapters
Summary April 29th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Målet med detta protokoll är att kvantifiera bindningen av eukaryota patogenen humant norovirus till bakterier. Efter att ha utfört en första virusbakterien fastsättningsanalys, flöde cytometri används för att upptäcka viralt bundna bakterier inom befolkningen.
Transcript
Virus-bakterieinteraktioner kan vara viktiga för framgångsrik virusinfektion och stimulering av ett värd immunsvar. Men för närvarande, mycket koncentrerad och renad lager av mänskliga norovirus kan inte produceras i labbet. Denna teknik kan användas med alla virus som binder till bakterier, för vilka antingen virusliknande partiklar eller levande virus finns tillgängliga.
Det gör det möjligt för oss att kvantifiera interaktioner mellan dessa virus och bakterier. Inokulera fem milliliter flytande medium med en enda isolerad koloni av Enterobacter cloacae från en agarplatta direkt från fryst glycerol lager. Odla bakterierna över natten.
Följande dag överför 1,3 milliliter alikvoter av kulturen till två separata 1,5 milliliter centrifugrör. Centrifugera rören vid 10, 000 x g i fem minuter. Ta bort supernatanterna och tvätta sedan proverna två gånger med en milliliter steril 1X PBS för varje tvätt.
Centrifugera proverna igen vid 10, 000 x g i fem minuter. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 1,3 milliliter steril 1X PBS. Från och med 0,5 milliliter tvättad kultur, seriellt späd bakterierna i 1X PBS från 10 till minus en till 10 till minus fyra.
Med hjälp av en spektrofotometer, mäta den optiska densiteten hos den tvättade outspädda kulturen och var och en av de fyra utspädningar vid 600 nanometer. Utför 10-faldiga serieutspädningar i 1X PBS för var och en av de tidigare spädningarna. Sprid 100 mikroliter av de tre sista utspädningarna för varje serie på agarplattor för att bestämma antalet kolonibildande enheter per milliliter för varje prov.
Låt plattorna torka i rumstemperatur i fem minuter. Invertera plattorna och inkubera dem i inkubatorn. Efter att ha förberett reagenserna, antikropparna och bakterierna enligt beskrivningen i manuskriptet, monterar du alla material i ett BSL-2-skåp för biosäkerhet.
Virusliknande partiklar för humant norovirus är listade som BSL-2 patogener och allt arbete utför med hjälp av VLP bör utföras i en certifierad biosäkerhet skåp. Tillsätt 10 mikrogram humant norovirus VLPs till varje tub av bakterier och blanda noggrant genom pipettering. Inkubera rören i en timme i 37 grader Celsius med konstant rotation.
Efter inkubation, centrifugera rören vid 10, 000 x g i fem minuter. Aspirera och kassera supernatanten och resuspend bakteriepelleten i en milliliter av PBS. Efter att tvätta stegen en gång, centrifugera rören igen vid 10, 000 X g i fem minuter.
Kassera supernatanten och resuspend VLP-bakteriepelleten i 150 mikroliter av 5%-blockerande buffert. Ett vanligt fel som uppstår är att rör byts ut och fel behandling läggs till. För att förhindra detta, ordna alla rör i linjer som motsvarar rätt behandling och lägg till en behandling på en gång till rören.
För varje bakterieprov, preparera 50 mikroliter av utspädd human norovirus GII-antikropp. Med hjälp av 5%blockerande buffert, späd antikroppen en till 125 för E.cloacae prover. Bered 50 mikroliter av utspädd isotypantikropp för varje bakterieprov med samma utspädningsförhållanden.
Dela upp varje fästanalysprov i 350 alikvoter med mikroliter genom att överföra dem till rena centrifugrör på 1,5 milliliter. För att skapa ofläckade kontroller, lägg till 50 mikroliter av blockerande buffert till den första alikvoten från varje bakterieprov. För de färgade proverna, tillsätt 50 mikroliter av GII-antikroppsutspädningen till den andra uppsättningen alikvoter.
Skapa isotype-kontrollerna genom att lägga till 50 mikroliter av den utspädda isotyp-antikroppen till den tredje uppsättningen alikvoter. Inkubera alla prover på is och i mörker i 30 minuter. Sedan centrifugera alla prover på 10, 000 X g i fem minuter.
Kassera supernatanterna och resuspend varje prov i 150 mikroliter av FCSB. Återigen centrifugera alla prover vid 10, 000 X g i fem minuter. Återigen, kasta supernatanterna och resuspend proverna i 100 mikroliter av FCSB.
Efter att ha centrifugerat proverna en sista gång och kasserat supernatanterna, återanvänder du proverna i 150 mikroliter av FCSB. Överför varje prov till ett rör som innehåller 400 mikroliter av FCSB för en total volym på 550 mikroliter. Förvara proverna på 4 grader Celsius tills de analyseras av flödescytometri.
VLP-fastsättning mättes med hjälp av flödescytometri. Först densitet tomter användes för att gate ut cellulära skräp, följt av efterföljande dot tomt gating att ta bort bakteriella dubbletar och cellulära klumpar. Representativa histogram visar brist på PE-signal i bakteriella endast prover och en förskjutning i PE signalintensitet i VLP:bakterieprover jämfört med obeskrivliga och isotyp kontroller.
Efter en timmes inkubation med 10 mikrogram VLP, upptäckte flödescytometri partikelbindning till både E.colacae och L.gasseri. För att bestämma gränsen för bindningskvantifiering för denna analys genererades en utspädningsserie av VLP före tillägg till bakterierna. Minskningar av mängden VLP resulterade i motsvarande minskningar till de procentiga bakterier som binds av VLP.
Att känna till förhållandet virus:bakterie och hålla förhållandet konsekvent mellan experiment är viktigt för att tolka resultat. Bakteriella och virala mutanter kan genereras för att specifikt bestämma de mikrobiella ytstrukturer som förmedlar denna interaktion. Denna teknik gör det möjligt för forskare att svara på frågor om omständigheter och tillstånd som påverkar norovirus-bakteriell interaktioner, inklusive hur förändringar i virus genotyp, bakterietillväxt villkor, och förändringar i bakteriella ytstrukturer ändra viral bindning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
