في نموذج المرض Microfluidic في المختبر لدراسة تفاعلات الدم الواهية الكاملة وديناميات تجلط الدم في الوقت الحقيقي

هذا في المختبر نموذج المرض، ويمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين الدم كله والخلايا المشتقة المريض، وتحديدا البطانية، لتقييم تجلط الدم وفعالية وكلاء تخثر. يمكن استخدام خلايا بطانة الدم هذه في ظروف مختلفة ويمكن تعديلها عن طريق إدخال ميكروفليديك حسب الطلب أو عن طريق ضبط معلمات تدفق الدم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة ديناميات خثرات في الظروف الالتهابية، أو لتقييم آثار العلاج المضاد للتخثر ومضادة للصفيحات.

في نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه النهج في طريقة الطب الشخصية. بعد الحصول على عينة جراحية من نسيج الشريان الرئوي البشري ، فإن الخلايا ذات التقارب العالي تربط طبق ثقافة الخلايا 60 ملليلتر مع ملليلترين من خمسة ميكروجرام لكل ملليلتر فيبورونيكتين واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. في نهاية الحضانة ، استخدم ملقطًا معقمة في خزانة تدفق لاريمينر في ظروف معقمة ، لنقل الأنسجة إلى طبق بيتري من PBS.

إذا كان النسيج لا يزال في حلقة، وقطع الشريان مفتوحة مع مقص، مع الحرص على عدم لمس الطبقة الأعمق من السفينة، كما البطانة هو تلف بسهولة وإزالتها. بعد إزالة الليفية، إضافة أربعة ملليلترات من خلية البطانية كاملة المتوسطة إلى الطبق واستخدام ملقط لنقل عينة الأنسجة إلى المتوسطة، واستخدام مشرط لكشط بعناية الطبقة الداخلية من السفينة في المتوسطة، مع الحرص على تجنب أي تراكمات الدهون التي لوحظت في جدار السفينة. بعد أن يتم حصاد الخلايا، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية.

إذا كانت الخلايا الليفية تلوث الثقافة، استخدم فصل خلية التقارب المغناطيسي لـ CD144، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لتنقية الخلايا. بشكل عام، يتم تعريف الثقافة بأنها نقية، عندما يكشف قياس التدفق عن 10٪ أو أقل من الخلايا الملوثة. عندما تم الحصول على العدد الكافي من الخلايا البطانية للاستخدام التجريبي، يمكن أن تتميز الخلايا البطانية الأولية لوجود علامات محددة الخلايا البطانية وعدم وجود العضلات الملساء وعلامات الخلية الظهارية.

لإعداد غرفة تدفق، رمز قناة واحدة من ستة شريحة تدفق جيدا مع 30 ميكرولترات من 0.1٪ الجيلاتين واحتضان هذه الشريحة لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى غرف التدفق التجاري، يمكن استخدام غرف التدفق المخصصة ذات الأبعاد المحددة لدراسة تأثير هندسة الأوعية الدموية على ديناميكيات الجلطة. في حين أن الشريحة هو احتضان، وجمع الخلايا من الشريان الرئوي قواطع ثقافة الخلايا البطانية مع EDTA والتبسين والرواسب التي الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 600 ميكرولترات من خلية البطانية كاملة المتوسطة وبقوة ولكن بلطف، إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا في كل قناة، إضافة 50 ميكرولترات إضافية من خلية البطانية كاملة متوسطة إلى القناة ، لتوفير وسيلة كافية للحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وتغيير المتوسطة في اليوم التالي لغسل الخلايا غير المنضمة.

بعد ستة أيام في الثقافة ، ينبغي أن تكون الخلايا شكلت أحادية النقوش مستقرة. في اليوم السابع من ثقافة الخلايا البطانية الشريان الرئوي، الحصول على عينات الدم الوريدي من الأشخاص الذين لا يتلقون العلاج ضد التخثر في 109 أحادية الصوديوم citrate أنابيب التخثر ونقل الدم إلى أنبوب 50 ملليلتر. يمكن أن يحتوي الدم على فيروسات وعوامل معدية أخرى.

ولذلك من المهم أن ارتداء القفازات دائما واتباع توجيهات السلامة للعمل مع المواد البشرية. وصفت Fluorescently خلايا الدم مع 1 إلى 10،000 تركيز من Calcein AM الأحمر و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر وإضافة اليكسا 488 الفيبرينوجين، ثم احتضان الدم في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بالامتصاص الكامل. قبل 30 دقيقة من النزف، علاج الخلايا البطانية الشريان الرئوي مع 100 ميكرولترات من الهيستامين ميكرومولار واحد في الخلايا البطانية المتوسطة و 1٪ مصل البقر الجنين دون أي إضافات أخرى.

واستخدام حقنة 20 ملليلتر مليئة العازلة غسل لشطف أنابيب نظام التدفق، تحميل حقنة من الثلث إلى 20 ملليلتر مع ملليلتر اثنين من عازلة غسل وتحميل الحقنة على مضخة حقنة. استخدام حقنة ثانية 20 ملليلتر لملء أنابيب التدفق مع الهيبيز بالإضافة إلى العازلة التي تحتوي على 1٪ من البوم المصل البقري واستخدام موصل شكل الكوع لورا لربط بعناية الأنابيب إلى الشريحة الصغيرة، وربط منفذ الشريحة إلى الحقنة، وإصلاح من المجهر عن طريق وضع الخلية التي تحتوي على الشريحة على خشبة المسرح وتجميع الإعداد للتجربة ، اضبط المجهر و قم بتعيين المعلمات للتصوير. إعادة تحديد الدم المؤكد.

وهذا هو سعيد الراعي المشترك للتخثر، وعلاوة على ذلك في محاولة لتجنب تشكيل فقاعات الهواء لأن هذا سوف تضررت طبقة الخلايا البطانية والتأثير على النتائج الخاصة بك. مباشرة قبل الضخ، وتمييع الدم في مرتين مع عازلة إعادة التكليس ووضع أنبوب مدخل الشريحة الدقيقة في أنبوب الدم، اضغط على بدء ضخ الحقنة. بمجرد أن يبدأ الدم يتدفق على بطانة الدم، اضغط على المجهر للحصول على الصور باستخدام القنوات النشطة المنتخبة مسبقا ومنطقة مراكز الاهتمام، كل 15 ثانية لمدة خمس دقائق.

في نهاية التحليل، ووقف تسجيل ومضخة الحقن وتنظيف بشكل صحيح. وضع علامات الصفائح الدموية مع Calcein AM الأحمر وإضافة اليكسا 488 الفيبرينوجين المترافق، ويسمح للتحقيق في تشكيل خثرة بواسطة التصاق الصفائح الدموية والألياف والترسب. في ظل ظروف غير محفزة ، لا يوجد أي ربط للصفائح الدموية أو الفيبرين بـ endothelium.

التحفيز مع الهستامين النتائج في زيادة فورية في التصاق الصفائح الدموية, التي تصل إلى هضبة بعد 2.5 دقيقة, في هذه المرحلة الزمنية, تبدأ الصفائح الدموية في إفراز العوامل الأوتكرين التي تحفز تجميع الصفائح الدموية وانشقاق الفيبرين إلى الفيبرين, مما أدى إلى الألياف والترسب في ثلاث دقائق وتشكيل تجميع مستقر مع الصفائح بعد أربع دقائق. العلاج مع مضاد التخثر المباشر، ويمنع كل من تشكيل جلطة والتصاق الصفائح الدموية بالمقارنة مع الدم غير المعالجة. تحليل مناعي للشريان الرئوي تفاعل الصفائح الدموية البطانية بعد خمس دقائق من الضخ، يكشف عن صيانة الخلية البطانية، والاتصالات الخلوية، كما أكد من قبل كادرين الأوعية الدموية تلطيخ، مشيرا إلى أن الجلطات الدموية تشكل على طبقات نموذج البطانية بدلا من على المصفوفة الأساسية بين الفجوات البطانية.

الخلايا الدموية الوريدية البشرية تظهر أقل التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين مقارنة مع بطانة الشريان الرئوي. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا البطانية البطانية الشريان الرئوي الأولية المريضة من مرضى ارتفاع ضغط الدم الرئوي المزمن الجلومبومبول، تظهر زيادة التصاق الصفائح الدموية وترسب أكثر فيبرين بالمقارنة مع الخلايا السليمة. تعتمد تخثر بطانة بطانة الجسم على عوامل متعددة مثل أصل سرير الأوعية الدموية أو أجزاء الخلفية البيولوجية.

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن اختبار الخلل الجوهري في مكونات الأوعية الدموية والدم، وكذلك فعالية العلاج المضاد للتخثر خلال مراحل مختلفة من تجلط الدم. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفهم تفاعلات الدم والثيو ، في مختلف الأمراض التخثرية مع إمكانية التنبؤ النهائي بالاستجابات الخاصة بالمريض لعلاج التخثر.