Kvantifiering av vävnadsspecifik proteostatisk nedgång i caenorhabditis elegans

Användningen av vävnad-specifika uttryck av polyglutamin fluorescerande reporter i C.elegans är betydande eftersom det tillåter upptäckt och karakterisering av proteostas regulatorer i samband med en intakt multicellulär organism. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör visualisering och kvantifiering av den åldersrelaterade nedgången i cellulär proteostas in vivo, vilket är viktigt för att få djupare mekanistisk insikt i hur organismer upprätthåller korrekt vikning och funktion av proteomet och effekterna av åldrande. Klargörande mekanismer som kan bevara proteostas kommer att underlätta utvecklingen av riktade insatser för behandling av åldrande associerade sjukdomar där proteostas äventyras och för att främja ett hälsosamt åldrande.

Proteostas kollaps är ett massivt klinikproblem, eftersom det ligger till grund för utvecklingen av proteinfelveckande sjukdomar, inklusive Alzheimers, Parkinsons, Huntingtons sjukdom och amyotrofisk lateral skleros. Börja med att använda Petriplattor med diametern 6 centimeter för att förbereda fem agarplattor för varje testtillstånd. För experiment med RNAi, inducera dsRNA-produktion i transformerad HT115 E.coli och använd RNAi agar.

Använd OP50 E.coli på standard NGM-agar för experiment utan RNAi. Odla E.coli-kulturerna över natten vid 37 grader Celsius medan du skakar vid 220 RPM. Nästa dag, pellet bakterierna genom centrifugering vid 2 400 G i 15 till 20 minuter, aspirera sedan supernatanten och suspendera pelleten i en tiondel av startvolymen av lb.

Aliquot 200 mikroliter av koncentrerade bakterier till varje tallrik och låt de öppna plattorna torka i en ren miljö tills all vätska har absorberats. För att synkronisera C.Elegans med hypokloritbehandling, tvätta gravid hermafroditer två gånger med M9-buffert, överför dem sedan till ett nytt rör och inkubera i 5 milliliter hypokloritlösning i fem minuter och skaka dem varje minut. Efter inkubationen, snurra ner djuren och tvätta dem tre gånger med M9-buffert.

Låt embryon kläckas i rör över natten i 3 milliliter M9-lösning med rotation vid 20 grader Celsius. Beräkna tätheten hos L1-djur genom att släppa 10 mikroliter L1-lösning tre gånger på en 6 centimeters tallrik och räkna antalet L1-djur. Blanda regelbundet L1-lösningarna för att förhindra att djuren sätter sig.

Frö 50 L1 ett djur på varje tallrik, räkna och registrera antalet sådda och flytta plattorna till en 20 grader Celsius inkubator. Alternativt, för att synkronisera djur via äggläggning, placera fem till tio unga, gravida vuxna djur på varje tallrik i fyra till sex timmar och låt dem lägga ägg tills det finns cirka 50 ägg per tallrik. Ta bort alla gravida vuxna och flytta plattorna med äggen till en 20 grader Celsius inkubator.

Odla djuren till L4-scenen, vilket tar cirka 40 timmar vid 20 grader Celsius. Tillsätt sedan 50 mikroliter på 160 gånger FUDR. För att mäta nedgången i proteostas i muskelvävnad, välj 20 djur och montera dem på en mikroskopbild med en 3% agarose pad och en 5 mikroliter droppe av 10 millimolar natrium azid.

När alla maskar är immobiliserade, föreställ hela djurens kroppar med en 10 X förstoringslins. Använd ett FITC- eller YFP-filter och samma exponering för varje djur. När bilderna är klara ignoreras bilderna.

Räkna antalet högborgar i hela djurets kroppsväggsmuskler. Foci är ljusare punkterade signaler som kan skiljas från dimmerlöslig signal i bakgrunden. På poängdagar, titta på plattorna med djuren och registrera antalet förlamade djur och ta sedan bort förlamade djur från plattan.

Vid slutförandet av experimentet beräknar du förlamningshastigheten för varje tillstånd och plottar förlamningsprogressionen. För att mäta nedgången i proteostas i neuronal vävnad, montera maskarna på en bild som tidigare beskrivits och ta Z stack bilder av djurens huvud på ett sammansatt mikroskop med hjälp av en 40 X förstoringslins. Ignorera bilderna efter avbildning.

Efter att ha förvärvat bilderna, platta Z-staplarna och använd dem för att kvantifiera antalet högborgar i nervceller som ligger på nervringområdet. Plotta utvecklingen av YFP-foci ackumulering från dag 4, 6, 8 och 10. På dag två av vuxen ålder, plocka 10 synkroniserade djur från plattan och placera dem på en 10 mikroliter droppe M9-buffert på en mikroskopbild.

Upprepa detta steg minst fyra gånger för att få ett prov på 40 eller fler djur. Video spelar in djurens rörelse under en period av 30 sekunder på ett stereomikroskop med en videokompatibla kamera. När alla videor med djuren som ska analyseras spelas in, spela videon och poängsätta kroppsböjningarna hos varje djur.

Rita upp antalet kroppsböjningar för varje djur i ett kolumndiagram, där varje punkt representerar antalet kroppsböjningar på 30 sekunder på Y-axeln och de olika förhållanden som testas på X-axeln. Polyglutamin upprepa modellen har varit avgörande för identifiering av gener som reglerar det proteostiska nätverket. Muskelspecifik polyQ-YFP uttryck resulterar i ackumulering av fluorescerande högborgar som är lätta att kvantifiera under ett enkelt fluorescerande dissekerande mikroskop.

Djuren blir förlamade under medelåldern, eftersom proteomet i muskeln kollapsar på grund av reporterns proteotoxiska effekt. Den åldersrelaterade nedgången i neuronal proteostas kan följas av direkt kvantifiering av aggregerad bildning och minskningar i samordnade kroppsböjningar efter att ha placerat djur i vätska. Denna metod har använts för att visa att homeo domänen interagerar proteinkinas, en transkriptionell kofaktor, påverkar proteostas under åldrande genom att reglera uttryck av autofagi och molekylära förkläden.

Förlusten av HPK-1 ökar antalet Q35-YFP-aggregat som ackumuleras under åldrandet. Kontrolldjur uppvisade i genomsnitt 18 aggregat, medan de behandlade djuren HPK1 null och HPK1 RNAi uppvisade i genomsnitt 28 respektive 26 aggregat. Dag åtta i vuxen ålder var 77 till 78% av HPK1 bristfälliga djur förlamade, jämfört med endast 50% av kontrollen.

Dessutom visades överuttryck av HPK1 att reglera protein aggregerad bildandet och skydda åldrande djur från Q35-YFP tillhörande förlamning under åldrande. Denna metod mäter allmän nedgång av proteomet inom en celltyp. Det finns många metoder för att bedöma förändringar i specifika komponenter i det prostatiska nätverket.

Tillsammans ger de en heltäckande bild. Minskande proteostas är ett kännetecken för åldrande. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att kvantifiera denna nedgång.

I kombination med genetisk analys är det ett kraftfullt verktyg för upptäckt.