2,740 Views
•
09:18 min
•
September 07, 2021
DOI:
Brugen af vævsspecifikt udtryk for polyglutamin fluorescerende reporter i C.elegans er betydelig, fordi det tillader opdagelse og karakterisering af proteostaseregulatorer i forbindelse med en intakt flercellet organisme. Den største fordel ved denne teknik er, at den tillader visualisering og kvantificering af det aldersrelaterede fald i cellulær proteostase in vivo, hvilket er vigtigt for at få dybere mekanistisk indsigt i, hvordan organismer opretholder korrekt foldning og funktion af proteomet og virkningerne af aldring. Belyse mekanismer, der er i stand til at bevare proteostase, vil lette udviklingen af målrettede interventioner til behandling af aldrende tilknyttede sygdomme, hvor proteostase bringes i fare, og for at fremme sund aldring.
Proteostase kollaps er et massivt klinikproblem, da det ligger til grund for udviklingen af proteinfoldende sygdomme, herunder Alzheimers, Parkinsons, Huntingtons Sygdom og amyotrofisk lateral sklerose. Begynd med at bruge petriplader med en diameter på 6 centimeter til at forberede fem agarplader til hver testtilstand. Til forsøg med RNAi, fremkalde dsRNA produktion i transformeret HT115 E.coli og bruge RNAi agar.
Brug OP50 E.coli på standard NGM agar til eksperimenter uden RNAi. Dyrk E.coli-kulturerne natten over ved 37 grader Celsius, mens du ryster ved 220 RPM. På den næste dag, pellet bakterierne ved centrifugering ved 2,400 G i 15 til 20 minutter, derefter aspirere supernatant og re-suspendere pellet i en tiendedel af startvolumen af lb.
Aliquot 200 mikroliter af koncentrerede bakterier til hver plade og lad de åbne plader tørre i et rent miljø, indtil al væske er absorberet. For at synkronisere C.Elegans med hypochloritbehandling skal du vaske gravid hermafroditer to gange med M9-buffer, derefter overføre dem til et frisk rør og inkubere i 5 milliliter hypochloritopløsning i fem minutter og ryste dem hvert minut. Efter inkubationen drejer du dyrene ned og vasker dem tre gange med M9-buffer.
Lad embryoner klække i rør natten over i 3 milliliter M9 opløsning med rotation ved 20 grader Celsius. Beregn tætheden af L1 dyr ved at droppe 10 mikroliter af L1 opløsning tre gange på en 6 centimeter plade og tælle antallet af L1 dyr. Bland regelmæssigt L1-løsningerne for at forhindre dyrene i at bosætte sig.
Frø 50 L1 et dyr på hver plade, tælle og registrere antallet seedet, og flytte pladerne til en 20 grader Celsius inkubator. Alternativt kan du for at synkronisere dyr via æglægning placere fem til ti unge, gravide voksne dyr på hver plade i fire til seks timer og give dem mulighed for at lægge æg, indtil der er ca. 50 æg pr. Plade. Fjern alle gravide voksne og flyt pladerne med æggene til en 20 grader Celsius inkubator.
Dyrene dyrkes indtil L4-trin, hvilket vil tage ca. 40 timer ved 20 grader Celsius. Derefter tilsættes 50 mikroliter af 160 gange FUDR. For at måle nedgangen i proteostase i muskelvæv, vælge 20 dyr og montere dem på et mikroskop dias med en 3% agarose pad og en 5 mikroliter fald på 10 millimolar natrium azid.
Når alle orme er immobiliseret, billede hele dyrenes kroppe ved hjælp af en 10 X forstørrelse linse. Brug et FITC- eller YFP-filter og den samme eksponering for hvert dyr. Når du er færdig, skal du kassere diasene.
Tæl antallet af foci i kroppen væggen muskler af hele dyret. Foci er lysere punkterede signaler, der kan skelnes fra lysdæmperen opløselige signal i baggrunden. På scoringsdage skal du se på pladerne med dyrene og registrere antallet af lammede dyr og derefter fjerne lammede dyr fra pladen.
Ved afslutningen af eksperimentet beregnes lammelseshastigheden for hver tilstand og plotter lammelsesudviklingen. For at måle nedgangen i proteostase i neuronalt væv, montere ormene på et dias som tidligere beskrevet og tage Z stak billeder af hovedet af dyrene på et sammensat mikroskop ved hjælp af en 40 X forstørrelse linse. Slet diasene efter billeddannelse.
Efter at have erhvervet billederne, flade Z stakke og bruge dem til at kvantificere antallet af foci i neuroner placeret på nervering område. Plot progressionen af YFP foci akkumulering fra dag 4, 6, 8 og 10. På dag to af voksenalderen skal du vælge 10 synkroniserede dyr fra pladen og placere dem på en 10 mikroliter dråbe M9-buffer på et mikroskop dias.
Gentag dette trin mindst fire gange for at få en prøve på 40 eller flere dyr. Video optager dyrenes bevægelse i en periode på 30 sekunder på et stereomikroskop med et videodygtigt kamera. Når alle videoer med de dyr, der skal analyseres, er optaget, skal du afspille videoen og score hvert dyrs kropsbøjninger.
Plot antallet af kropsbøjninger for hvert dyr i en søjlegraf, hvor hver prik repræsenterer antallet af kropsbøjninger på 30 sekunder på Y-aksen og de forskellige forhold, der testes på X-aksen. Polyglutamin repeat model har været medvirkende til identifikation af gener, der regulerer proteostatic netværk. Muskel-specifikke polyQ-YFP udtryk resulterer i ophobning af fluorescerende foci, der er nemme at kvantificere under en simpel fluorescerende dissekering mikroskop.
Dyrene bliver lammet i midlife, da proteomet i musklen kollapser på grund af journalistens proteotoksiske virkning. Det aldersrelaterede fald i neuronal proteostase kan efterfølges af direkte kvantificering af den samlede dannelse og fald i koordinerede kropsbøjninger efter at have placeret dyr i væske. Denne metode er blevet brugt til at vise, at homeo domæne interagere protein kinase, en transskriptionel cofaktor, påvirker proteostase under aldring ved at regulere udtryk for autofagi og molekylære chaperoner.
Tabet af HPK-1 øger antallet af Q35-YFP aggregater, der akkumuleres under aldring. Kontroldyrene udviste i gennemsnit 18 aggregater, mens de HPK1 null-mutante og HPK1 RNAi-behandlede dyr i gennemsnit udviste henholdsvis 28 og 26 granulater. På dag otte af voksenalderen var 77 til 78% af HPK1-mangelfulde dyr lammet, sammenlignet med kun 50% af kontrollen.
Derudover blev overekspression af HPK1 påvist at regulere proteinaggregatdannelse og beskytte aldrende dyr mod Q35-YFP-associeret lammelse under aldring. Denne metode måler proteomets generelle tilbagegang inden for en celletype. Der findes mange metoder til at vurdere ændringer i specifikke komponenter i prostatanetværket.
Sammen giver de et samlet billede. Faldende proteostase er et kendetegn for aldring. Denne tilgang gør det muligt for forskere at kvantificere dette fald.
Når det kombineres med genetisk analyse, er det et kraftfuldt værktøj til opdagelse.
Proteostatisk tilbagegang er kendetegnende for aldring, der letter starten af neurodegenerative sygdomme. Vi skitserer en protokol til kvantificerbart måle proteostase i to forskellige Caenorhabditis elegans væv gennem heterologe udtryk for polyglutamin gentagelser smeltet til en fluorescerende reporter. Denne model giver mulighed for hurtig in vivo genetisk analyse af proteostase.
Read Article
Cite this Article
Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).
Copy