قياس الانخفاض البروتيني البروتيوستيكي الخاص بالأنسجة في إليجانات Caenorhabditis

استخدام التعبير عن الأنسجة محددة من مراسل الفلورسنت polyglutamine في C.elegans مهم لأنه يسمح باكتشاف وتوصيف المنظمين البروتيوستاسي في سياق كائن حي متعدد الخلايا سليمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور والتقدير الكمي للانخفاض المرتبط بالعمر في البروتيوستاسيس الخلوي في الجسم الحي ، وهو أمر ضروري للحصول على رؤية ميكانيكية أعمق في كيفية الحفاظ على الكائنات الحية للطي المناسب ووظيفة البروتيوم وآثار الشيخوخة. إن توضيح الآليات القادرة على الحفاظ على داء البروتيوستاسي سيسهل تطوير التدخلات المستهدفة لعلاج الأمراض المرتبطة بالشيخوخة التي يتعرض فيها البروتيوستاسي للخطر وتعزيز الشيخوخة الصحية.

انهيار البروتيوستاسي هو مشكلة عيادة ضخمة ، لأنه يكمن وراء تطور أمراض طي البروتين ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، باركنسون ، مرض هنتنغتون ، والتصلب الجانبي الضموري. ابدأ باستخدام لوحات بيتري قطرها 6 سنتيمترات لإعداد خمس لوحات أجار لكل حالة اختبار. للتجارب مع RNAI، حث إنتاج dsRNA في تحويل HT115 E.coli واستخدام أجار RNAI.

استخدم OP50 E.coli على أجار NGM القياسي للتجارب بدون RNAi. تنمو ثقافات الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بينما تهتز عند 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 2، 400 G لمدة 15 إلى 20 دقيقة، ثم يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في عشر حجم بدءا من رطل.

Aliquot 200 ميكرولتر من البكتيريا المركزة لكل لوحة والسماح للوحات مفتوحة لتجف في بيئة نظيفة حتى تم امتصاص جميع السائل. لمزامنة C.Elegans مع علاج الهيبوكلوريت ، اغسل هيرمافروديت gravid مرتين مع المخزن المؤقت M9 ، ثم قم بنقلها إلى أنبوب جديد واحتضانها في 5 ملليلتر من محلول الهيبوكلوريت لمدة خمس دقائق ، وهزها كل دقيقة. بعد الحضانة، تدور أسفل الحيوانات وغسلها ثلاث مرات مع المخزن المؤقت M9.

السماح للأجنة بالفقس في أنابيب بين عشية وضحاها في 3 ملليلتر من محلول M9 مع دوران عند 20 درجة مئوية. حساب كثافة الحيوانات L1 عن طريق إسقاط 10 ميكرولتر من محلول L1 ثلاث مرات على لوحة 6 سم والعد عدد الحيوانات L1. بشكل دوري، اخلطي حلول L1 لمنع الحيوانات من الاستقرار.

البذور 50 L1 واحد على كل لوحة، عد وتسجيل عدد المصنفين، ونقل لوحات إلى حاضنة 20 درجة مئوية. بدلا من ذلك، لمزامنة الحيوانات عن طريق وضع البيض، ضع خمسة إلى عشرة بالغة صغيرة ومرشدة على كل طبق لمدة أربع إلى ست ساعات والسماح لهم بوضع البيض حتى يكون هناك ما يقرب من 50 بيضة لكل طبق. إزالة جميع البالغين gravid ونقل لوحات مع البيض إلى حاضنة 20 درجة مئوية.

زراعة الحيوانات حتى المرحلة L4، والتي سوف تستغرق ما يقرب من 40 ساعة في 20 درجة مئوية. ثم أضف 50 ميكرولتر من 160 مرة FUDR. لقياس الانخفاض في النتوءات في الأنسجة العضلية، اختر 20 حيوانا ووضعها على شريحة مجهر مع وسادة agarose 3٪ وقطلة 5 ميكرولتر من 10 ملليمولار من الصوديوم azide.

بعد أن يتم شل حركة جميع الديدان ، صور الأجسام الكاملة للحيوانات باستخدام عدسة تكبير 10 X. استخدم فلتر FITC أو YFP ونفس التعرض لكل. عند الانتهاء، تجاهل الشرائح.

عد عدد بؤر في عضلات جدار الجسم من الحيوان كله. البؤر هي إشارات أكثر إشراقا تتخللها التي يمكن تمييزها عن إشارة قابلة للذوبان باهتة في الخلفية. في أيام التسجيل ، انظر إلى اللوحات مع الحيوانات وسجل عدد الحيوانات المشلولة ، ثم قم بإزالة الحيوانات المشلولة من الطبق.

عند الانتهاء من التجربة، وحساب معدل الشلل لكل حالة ورسم تطور الشلل. لقياس الانخفاض في البروتيوستازي في الأنسجة العصبية ، قم بتركيب الديدان على شريحة كما هو موضح سابقا واأخذ صور Z stack لرأس الحيوانات على مجهر مركب باستخدام عدسة تكبير 40 X. تجاهل الشرائح بعد التصوير.

بعد الحصول على الصور، تسطيح مداخن Z واستخدامها لتحديد عدد البؤر في الخلايا العصبية الموجودة على منطقة حلقة العصب. رسم تطور تراكم بؤر YFP من الأيام 4 و 6 و 8 و 10. في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ، اختر 10 متزامنة من الطبق ووضعها على قطرة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 على شريحة المجهر.

كرر هذه الخطوة أربع مرات على الأقل للحصول على عينة من 40 حيوانا أو أكثر. يسجل الفيديو حركة الحيوانات لمدة 30 ثانية على مجهر ستيريو مع كاميرا قادرة على الفيديو. مرة واحدة يتم تسجيل جميع أشرطة الفيديو مع الحيوانات التي سيتم تحليلها، وتشغيل الفيديو وتسجيل الانحناءات الجسم من كل.

رسم عدد الانحناءات الجسم لكل في الرسم البياني العمود، حيث تمثل كل نقطة عدد الانحناءات الجسم في 30 ثانية على محور Y والظروف المختلفة التي تم اختبارها على محور X. كان نموذج تكرار البوليغلوتامين مفيدا في تحديد الجينات التي تنظم الشبكة البروتيوستاتيكية. ينتج عن تعبير متعدد العضلات-YFP تراكم بؤر فلورية يسهل تحديدها كميا تحت مجهر تشريح فلوري بسيط.

تصبح الحيوانات مشلولة خلال منتصف العمر ، حيث ينهار البروتيوم داخل العضلات بسبب التأثير البروتيوكسي للمراسل. يمكن متابعة الانخفاض المرتبط بالعمر في البروتيستاسيس العصبي من خلال التحديد الكمي المباشر للتشكيل الكلي والانخفاضات في الانحناءات المنسقة للجسم بعد وضع الحيوانات في السائل. وقد استخدمت هذه الطريقة لإظهار أن مجال هونو التفاعل بين كيناز البروتين، وهو عامل مساعد النسخ، يؤثر على البروتيوستاسي أثناء الشيخوخة من خلال تنظيم التعبير عن autophagy والمرافقين الجزيئية.

فقدان HPK-1 يزيد من عدد المجاميع Q35-YFP التي تتراكم أثناء الشيخوخة. وعرضت التحكم ما متوسطه 18 تجميعا، في حين أظهرت الحيوانات المعالجة من نوع HPK1 null mutant وHPK1 RNAi ما متوسطه 28 و26 تجميعا على التوالي. بحلول اليوم الثامن من مرحلة البلوغ، أصيب 77 إلى 78٪ من الحيوانات الناقصة HPK1 بالشلل، مقارنة ب 50٪ فقط من السيطرة.

بالإضافة إلى ذلك ، تم إثبات الإفراط في التعبير عن HPK1 لتنظيم تكوين البروتين الكلي وحماية الحيوانات القديمة من الشلل المرتبط ب Q35-YFP أثناء الشيخوخة. تقيس هذه الطريقة الانخفاض العام للبروتيوم داخل نوع الخلية. توجد العديد من الطرق لتقييم التغيرات في مكونات محددة من الشبكة البروستاتا.

معا، فإنها توفر صورة شاملة. انخفاض البروتيوستاسي هو السمة المميزة للشيخوخة. ويسمح هذا النهج للباحثين بتحديد هذا الانخفاض كميا.

عندما يقترن التحليل الجيني، انها أداة قوية للاكتشاف.