昆虫关键热极限的高通量测定

热耐受性是物种分布和应对气候变化的关键组成部分。在这里，我们提供快速评估小昆虫耐热和耐寒性的方法。这些通过临界热最小值和热耐受性测量冷耐受性的方法，通过热敲落时间测量是高吞吐量、半自动化的，并且需要最少的设备。

演示这个程序的将是大卫·奥德，一个来自我实验室的博士后。要设置关键的热最小检测，请打开温度控制液浴电源，然后按下播放按钮运行程序，将浴池温度升高并保持在 25 摄氏度。等待 5 到 10 分钟，使流体浴室柱达到 25 摄氏度，然后用直径 5.08 厘米的过滤器更换柱顶的插头。

通过漏斗将大约 40 只苍蝇从食物小瓶中插入柱子，然后快速用插头更换漏斗，注意不要让任何苍蝇逃脱。然后让苍蝇安顿下来。偶尔敲打底塞鼓励苍蝇爬。

五分钟后，按流体浴增益上的启动按钮，开始关键的热最小斜坡程序。单击以打开计算机上的热情侣记录软件，然后单击记录开始记录列内的温度，在检测持续时间的每一秒。确保每个温度记录都包含特定于第二个温度采样的时间戳，以便以后可以将温度数据与 Drophila 漏斗监视器的数据合并。

将五毫升 90%乙醇加入 15 毫升锥形离心管中，并将管放在柱下方的机架中。偶尔点击柱子的底部插头，以吸引底部的任何苍蝇爬。大多数苍蝇将栖息在栖息处或靠近柱顶15摄氏度。

在15摄氏度下，将一个75毫米的外径玻璃漏斗放入果蝇漏斗监测器中。拆下底部插头并收集乙醇插头上仍在拔下的任何苍蝇。调整反火环、漏斗监视器和漏斗，使它们在柱子下。

确保漏斗的唇完全密封柱底，并将漏斗底部插入 15 毫升收集管中。打开果蝇漏斗监控软件。该软件将立即开始记录苍蝇达到其临界热最小的时间和日期。

达到临界热小热量的苍蝇，将失去神经肌肉功能，并通过果蝇漏斗监测器从栖息状态下降。要监控所有苍蝇是否已达到其临界热最小值，当温度降低时，请检查顶部插头和栖息，以查看是否有苍蝇仍然栖息。当所有的苍蝇，已经达到其临界热最小，移动果蝇漏斗监测仪和漏斗远离柱开口。

在极少数情况下，苍蝇可能达到其临界热最小值，但会卡在柱子中。打开顶部插头以卸下这些苍蝇。要建立高通量热敲下来测定，使用吸气器和隔膜盖，将个别二氧化碳静种苍蝇装入每个井中，一个经过改造的96井没有底板，用一个清晰的紧固盖密封板。

然后将盘子放在食物供应上，让苍蝇适应96井板至少48小时。在测定当天，将孵化器设定为37.5摄氏度，30分钟后将飞培养板放入孵化器，将板的底部与托盘底部的白纸对。请注意托盘上和网络摄像头框架中井柱和行名称的方向，并沿板的两侧和边缘放置彩色胶带，以帮助验证方向。

当板就位时，关闭孵化器门，然后单击视频录制软件中的记录。两小时后，检查录音，看看所有的苍蝇，是否已经到达他们最后的休息点，并停止移动。当所有苍蝇停止移动时，单击”停止”并处置苍蝇。

打开视频文件，记录每只飞井的击倒时间。在试验和观察之间，最一致的测量热量是苍蝇到达其最后休息点的时间。然后反向跟踪视频，专注于单个井，并注意到苍蝇首先离开其最后休息点的时间。

确定每只苍蝇的最后休息时间可能很困难。为了确保准确的分析，重要的是花时间并单独观察每个数据。在这个代表性的分析中，来自果蝇遗传参考面板线的女性比来自DGRP线714的女性具有明显较低的平均热最小温度。

此外，热量在37.5摄氏度，与73和461DGRP线的女性差异显著。稍作修改，这种测量热落时间的方法可用于测量其他热耐受性特性，如冷-昏迷恢复时间或临界热最大值。通过显著减少研究人员的动手时间，这些方法使得基因变异和热耐受性特征的探索能够以以前不可能实现的规模进行。