Hoge doorvoertesten van kritieke thermische grenzen bij insecten

Thermische tolerantie is een essentieel onderdeel van de verdeling van soorten en de reacties op klimaatverandering. Hier bieden we methoden voor het snel beoordelen van warmte- en koudetolerantie bij kleine insecten. Deze methoden voor het meten van koudetolerantie, via het kritische thermische minimum en warmtetolerantie, via warmte neergehaalde tijd zijn hoge doorvoer, semi-geautomatiseerd en vereisen minimale apparatuur.

Het aantonen van de procedure zal David Awde zijn, een postdoc uit mijn laboratorium. Om een kritische thermische minimale test op te zetten, stroom op een temperatuurgecontroleerd vloeistofbad en druk op de afspeelknop om een programma uit te voeren, waardoor de temperatuur van het bad stijgt en blijft tot 25 graden Celsius. Wacht vijf tot tien minuten om de vloeibare badkamerkolom 25 graden Celsius te laten bereiken, voordat u de stekker aan de bovenkant van de kolom vervangt door een filter met een diameter van 5,08 centimeter.

Tik ongeveer 40 vliegen van hun voedsel flacon in de kolom door de trechter en vervang snel de trechter met de stekker, waarbij u ervoor zorgt dat er geen vliegen ontsnappen. Laat de vliegen dan zich vestigen. Af en toe tikken op de onderste stekker aan te moedigen de vliegen te klimmen.

Na vijf minuten druk je op de startknop op de vloeistofbadaanwinst, om te beginnen met het kritieke thermische minima ramping-programma. Klik om de thermische paar opname software op de computer te openen en klik op record om te beginnen met het opnemen van de temperatuur in de kolom, elke seconde voor de duur van de test. Zorg ervoor dat elke temperatuurregistratie de tijdstempel bevat die specifiek is voor de tweede, zodat temperatuurgegevens later kunnen worden samengevoegd met gegevens van de Trechtermonitor van Drosophila.

Voeg vijf milliliter ethanol van 90% toe aan een conische centrifugebuis van 15 milliliter en plaats de buis in een rek onder de kolom. Af en toe tik op de onderste stekker van de kolom om eventuele vliegen te verleiden op de bodem te klimmen. De meeste vliegen zullen op een baars of in de buurt van de top van de kolom met 15 graden Celsius.

Bij 15 graden Celsius plaatst u een glazen trechter met een buitendiameter met een buitendiameter van 75 millimeter in de Trechtermonitor van Drosophila. Verwijder de onderste stekker en verzamel alle vliegen nog op de stekker in de ethanol. Pas de retortring, trechtermonitor en trechter aan, zodat ze onder de kolom staan.

Zorg ervoor dat de lip van de trechter de onderkant van de kolom volledig afdicht en de onderkant van de trechter in de 15 milliliter opvangbuis plaatst. Open de Drosophila trechtermonitorsoftware. De software zal onmiddellijk beginnen met het opnemen van de tijd en datum waarop de vliegen hun kritische thermische minima bereiken.

Vliegen die hun kritische thermische minima bereiken, verliezen hun neuromusculaire functie en vallen van hun zitstokken, via de Drosophila trechtermonitor. Om te controleren of alle vliegen hun kritische thermische minima hebben bereikt, als de temperatuur daalt, controleer de bovenste stekker en zitstokken om te zien of er nog vliegen zijn vastgestreken. Wanneer alle vliegen, hebben bereikt hun kritische thermische minima, verplaats de Drosophila trechter monitor en trechter uit de buurt van de kolom opening.

In zeldzame gevallen kunnen vliegen hun kritische thermische minima bereiken, maar blijven ze vastzitten in de kolom. Open de bovenste stekker om deze vliegen te verwijderen. Voor het opzetten van een hoge doorvoer warmte neergehaald test, gebruik maken van een aspirator en septum deksel, om individuele kooldioxide verdoofd vliegen te laden, in elke put van een gemodificeerde 96 goed geen bodemplaat en verzegelen de plaat met een duidelijke nauwsluitende deksel.

Plaats vervolgens de plaat over een voorraad voedsel en laat de vliegen te acclimatiseren aan de 96 goed plaat voor ten minste 48 uur. Zet de couveuse op de dag van de test op 37,5 graden Celsius, plaats na 30 minuten de vliegcultuurplaat in de couveuse met de onderkant van de plaat tegen het wit papier op de bodem van de lade. Let op de oriëntatie van de putkolom- en rijnamen op de lade en in het frame van de webcam en plaats gekleurde tape langs de zijkanten en randen van de plaat om de oriëntatie te verifiëren.

Wanneer de plaat in positie is, sluit u de incubatordeur en klikt u op opnemen in de video-opnamesoftware. Na twee uur, controleer de opname om te zien of alle van de vliegen, hebben bereikt hun laatste rustplaats en gestopt met bewegen. Wanneer alle vliegen zijn gestopt met bewegen, klik op stoppen en gooi de vliegen.

Open het videobestand en neem de knockdown-tijd van elke vlieg in elke put op. De meest consistente maatregel van de warmte neergehaald downtime tussen de proeven en waarnemingen is het tijdstip waarop een vlieg bereikt zijn laatste rustplaats. Volg vervolgens de video in omgekeerde richting, gericht op een enkele put en wijzend op het tijdstip waarop de vlieg eerst beweegt uit zijn laatste rustplaats.

Het bepalen van de laatste rusttijd van elke vlieg kan moeilijk zijn. Om een nauwkeurige analyse te garanderen, is het belangrijk om de tijd te nemen en elk goed individueel te observeren. In deze representatieve analyse hadden vrouwen uit de drosophila genetische referentiepaneellijn aanzienlijk lagere gemiddelde thermische minimatemperaturen dan vrouwen uit de DGRP-lijn 714.

Bovendien, de warmte neergehaald tijd op 37,5 graden Celsius, aanzienlijk verschillen tussen de vrouwtjes uit de 73 en 461 DGRP lijnen. Met kleine wijzigingen, deze methode voor het meten van de warmte neergehaald tijd, kan worden gebruikt om andere thermische tolerantie eigenschappen te meten, zoals chill-coma recovery time of kritische thermische maximum. Door de hands-on tijd voor onderzoekers aanzienlijk te verminderen, hebben deze methoden het mogelijk gemaakt om genetische variatie- en thermische tolerantiekenmerken te verkennen op een schaal die voorheen niet mogelijk was.