Analisi ad alta velocità di produzione dei limiti termici critici negli insetti

La tolleranza termica è una componente critica delle distribuzioni delle specie e delle risposte ai cambiamenti climatici. Qui forniamo metodi per valutare rapidamente la tolleranza al calore e al freddo nei piccoli insetti. Questi metodi per misurare la tolleranza al freddo, attraverso il minimo termico critico e la tolleranza al calore, attraverso il tempo di abbazione del calore sono ad alta produttività, semi-automatizzati e richiedono attrezzature minime.

A dimostrare la procedura sarà David Awde, un postdoc del mio laboratorio. Per impostare un saggio minimo termico critico, alimentare un bagno fluido a temperatura controllata e premere il pulsante di riproduzione per eseguire un programma, aumentando e mantenendo la temperatura del bagno a 25 gradi Celsius. Attendere da cinque a 10 minuti per consentire alla colonna del bagno fluido di raggiungere i 25 gradi Celsius, prima di sostituire la spina nella parte superiore della colonna con un filtro di 5,08 centimetri di diametro.

Tocca circa 40 mosche dalla fiala alimentare nella colonna attraverso l’imbuto e sostituisci rapidamente l’imbuto con la spina, facendo attenzione a non lasciare che le mosche scappino. Quindi lascia che le mosche si sistemino. Occasionalmente toccando la spina inferiore per incoraggiare le mosche a salire.

Dopo cinque minuti, premere il pulsante di avvio sul guadagno del bagno fluido, per iniziare il programma critico di rampatura dei minimi termici. Fare clic per aprire il software di registrazione della coppia termica sul computer e fare clic su registra per iniziare a registrare la temperatura all’interno della colonna, ogni secondo per la durata del saggio. Assicurarsi che ogni registrazione della temperatura includa il timestamp specifico del secondo, in modo che i dati sulla temperatura possano essere successivamente uniti ai dati del monitor dell’imbuto Drosophila.

Aggiungere cinque millilitri di etanolo al 90% a un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri e posizionare il tubo in un rack sotto la colonna. Occasionalmente toccare la spina inferiore della colonna per invogliare eventuali mosche sul fondo a salire. La maggior parte delle mosche sarà su un tresolo o vicino alla parte superiore della colonna di 15 gradi Celsius.

A 15 gradi Celsius, posizionare un imbuto di vetro di diametro esterno di 75 millimetri nel monitor dell’imbuto Drosophila. Rimuovere la spina inferiore e raccogliere eventuali mosche ancora sulla spina nell’etanolo. Regolare l’anello di ritocco, il monitor dell’imbuto e l’imbuto, in modo che si trovano sotto la colonna.

Assicurarsi che il labbro dell’imbuto sigilli completamente il fondo della colonna e inserire il fondo dell’imbuto nel tubo di raccolta da 15 millilitri. Aprire il software di monitoraggio dell’imbuto Drosophila. Il software inizierà immediatamente a registrare l’ora e la data in cui le mosche raggiungono i loro minimi termici critici.

Le mosche che raggiungono i loro minimi termici critici, perderanno la loro funzione neuromuscolare e cadranno dai loro posatoi, attraverso il monitor dell’imbuto Drosophila. Per monitorare se tutte le mosche hanno raggiunto i loro minimi termici critici, man mano che la temperatura diminuisce, controlla la spina superiore e i posatoi per vedere se alcune mosche sono ancora appollaiati. Quando tutte le mosche, hanno raggiunto i loro minimi termici critici, spostare il monitor dell’imbuto Drosophila e l’imbuto lontano dall’apertura della colonna.

In rare occasioni, le mosche possono raggiungere i loro minimi termici critici, ma rimangono bloccate nella colonna. Aprire la spina superiore per rimuovere queste mosche. Per impostare un saggio di riduzione del calore ad alta produttività, utilizzare un aspiratore e un coperchio del setto, caricare singole mosche sedate di anidride carbonica, in ogni pozzo di un pozzo modificato 96 senza piastra inferiore e sigillare la piastra con un coperchio aderente chiaro.

Quindi posizionare il piatto su una scorta di cibo e consentire alle mosche di acclimatarsi al piatto di 96 pozze per almeno 48 ore. Il giorno del test, impostare l’incubatore a 37,5 gradi Celsius, dopo 30 minuti posizionare la piastra di coltura della mosca nell’incubatore con il fondo del piatto contro la carta bianca sul fondo del vassoio. Si noti l’orientamento dei nomi delle colonne e delle righe del pozzo sul vassoio e nel telaio della webcam e posizionare il nastro colorato lungo i lati e i bordi della piastra per verificare l’orientamento.

Quando la piastra è in posizione, chiudere la porta dell’incubatore e fare clic su registra nel software di registrazione video. Dopo due ore, controlla la registrazione per vedere se tutte le mosche, hanno raggiunto il loro punto di riposo finale e hanno smesso di muoversi. Quando tutte le mosche hanno smesso di muoversi, fai clic su interrompi e smaltisci le mosche.

Apri il file video e registra il tempo di knockdown di ogni volo in ogni pozzo. La misura più coerente del tempo di inattività del calore abbattuto tra le prove e le osservazioni è il momento in cui una mosca raggiunge il suo punto di riposo finale. Quindi traccia il video al contrario, concentrandosi su un singolo pozzo e notando il momento in cui la mosca si sposta per la prima volta dal suo punto di riposo finale.

Determinare il tempo di riposo finale di ogni mosca può essere difficile. Per garantire un’analisi accurata, è importante prendersi il proprio tempo e osservarli singolarmente. In questa analisi rappresentativa, le femmine della linea del pannello genetico di riferimento Drosophila avevano temperature minime termiche medie significativamente inferiori rispetto alle femmine della linea 714 della DGRP.

Inoltre, il tempo di riduzione del calore a 37,5 gradi Celsius differisce significativamente tra le femmine dalle linee 73 e 461 DGRP. Con piccole modifiche, questo metodo per misurare il tempo di abbattire il calore, potrebbe essere utilizzato per misurare altri tratti di tolleranza termica, come il tempo di recupero del peperoncino-coma o il massimo termico critico. Riducendo significativamente il tempo pratico per gli investigatori, questi metodi hanno permesso l’esplorazione di variazioni genetiche e tratti di tolleranza termica su una scala che prima non era possibile.