Analyser med høy gjennomstrømning av kritiske termiske grenser i insekter

Termisk toleranse er en kritisk komponent i artsfordelingene og reaksjonene på klimaendringene. Her gir vi metoder for raskt å vurdere varme og kald toleranse i små insekter. Disse metodene for å måle kald toleranse, via den kritiske termiske minimum og varmetoleranse, via varme slått ned tid er høy gjennomstrømning, semi-automatisert og krever minimalt utstyr.

Å demonstrere prosedyren vil være David Awde, en postdoktor fra laboratoriet mitt. For å sette opp en kritisk termisk minimumsanalyse, strøm på et temperaturkontrollert væskebad og trykk på avspillingsknappen for å kjøre et program, heve og opprettholde temperaturen på badet til 25 grader Celsius. Vent fem til 10 minutter for å la væskebadkolonnen nå 25 grader Celsius, før du erstatter pluggen øverst i kolonnen med et 5,08 centimeter diameterfilter.

Trykk ca 40 fluer fra deres mat hetteglass inn i kolonnen gjennom trakten og raskt erstatte trakten med pluggen, ta vare på ikke å la noen fluer unnslippe. La deretter fluene bosette seg. Av og til trykker du på bunnpluggen for å oppmuntre fluene til å klatre.

Etter fem minutter trykker du på startknappen på væskebadsøkningen, for å starte det kritiske termiske minima-rampeprogrammet. Klikk for å åpne den termiske par opptaksprogramvaren på datamaskinen og klikk ta opp for å begynne å registrere temperaturen inne i kolonnen, hvert sekund i løpet av analysen. Kontroller at hvert temperaturopptak inkluderer tidsstempelet som er spesifikt for det andre, slik at temperaturdata senere kan slås sammen med data fra Drosophila traktmonitoren.

Tilsett fem milliliter med 90% etanol til et 15 milliliter konisk sentrifugerør og legg røret i et stativ under kolonnen. Av og til trykker du på den nederste pluggen på kolonnen for å lokke eventuelle fluer på bunnen for å klatre. De fleste fluene vil være på en abbor eller nær toppen av kolonnen med 15 grader Celsius.

Ved 15 grader Celsius plasserer du en 75 millimeter ytre diameter glasstrakt i Drosophila traktmonitoren. Fjern bunnpluggen og samle eventuelle fluer som fortsatt er på pluggen i etanol. Juster retortringen, traktskjermen og trakten, slik at de er under kolonnen.

Pass på at leppen på trakten helt forsegler bunnen av kolonnen og setter bunnen av trakten inn i 15 milliliter oppsamlingsrøret. Åpne Drosophila trakt monitor programvare. Programvaren vil umiddelbart begynne å registrere tid og dato da fluene når sin kritiske termiske minima.

Fluer som når sin kritiske termiske minima, vil miste sin nevromuskulære funksjon og falle fra perches, gjennom Drosophila traktmonitor. For å overvåke om alle fluene har nådd sin kritiske termiske minima, da temperaturen minker, sjekk topppluggen og perches for å se om noen fluer fortsatt er plassert. Når alle fluene, har nådd sin kritiske termiske minima, flytt Drosophila traktmonitoren og trakt bort fra kolonneåpningen.

I sjeldne tilfeller kan fluer nå sin kritiske termiske minima, men forbli fast i kolonnen. Åpne den øverste pluggen for å fjerne disse fluene. For å sette opp en høy gjennomstrømningsvarme slått ned analyse, bruk en aspirator og septum lokk, for å laste individuelle karbondioksid sederte fluer, inn i hver brønn av en modifisert 96 godt ingen bunnplate og forsegle platen med et klart tettsittende lokk.

Legg deretter platen over en tilførsel av mat og la fluene akklimatisere seg til 96-brønnplaten i minst 48 timer. På analysedagen setter du inkubatoren til 37,5 grader Celsius, etter 30 minutter plasserer du flykulturplaten i inkubatoren med bunnen av platen mot det hvite papiret på bunnen av skuffen. Legg merke til retningen på brønnkolonne- og radnavnene på skuffen og i rammen av webkameraet, og plasser farget tape langs sidene og kantene på platen for å bekrefte retningen.

Når platen er på plass, lukker du inkubatordøren og klikker på spill inn i videoopptaksprogramvaren. Etter to timer, sjekk opptaket for å se om alle fluene, har nådd sitt siste hvilested og sluttet å bevege seg. Når alle fluene har sluttet å bevege seg, klikk stopp og kast fluene.

Åpne videofilen og ta opp knockdown-tiden for hver fly i hver brønn. Det mest konsistente målet på varmen slått ned nedetid mellom forsøkene og observasjonene er tiden da en flue når sitt siste hvilested. Deretter sporer du videoen i revers, med fokus på en enkelt brønn og noterer seg tidspunktet da flyet først beveger seg av sitt siste hvilested.

Å bestemme den siste hviletiden for hver flue kan være vanskelig. For å sikre en nøyaktig analyse, er det viktig å ta deg tid og å observere hver brønn individuelt. I denne representative analysen hadde kvinner fra Drosophila genetisk referansepanellinje betydelig lavere gjennomsnittlig termisk minimatemperatur enn kvinner fra DGRP-linjen 714.

I tillegg slo varmen ned tiden på 37,5 grader Celsius, varierer betydelig mellom kvinner fra 73 og 461 DGRP linjer. Med mindre modifikasjoner, denne metoden for å måle varmen slått ned tid, kan brukes til å måle andre termiske toleranse trekk, for eksempel chill-koma utvinning tid eller kritisk termisk maksimum. Ved å redusere den praktiske tiden for utprøvere betydelig, har disse metodene tillatt utforskning av genetisk variasjon og termiske toleransetrekk i en skala som ikke tidligere var mulig.