التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

يجعل من الممكن اكتشاف بروتينات إصلاح الحمض النووي ، وصور التوظيف المكاني والزماني ويساعد على استجواب تفاعلات البروتين البروتيني في موقع تلف الحمض النووي. بعد تلف الحمض النووي، يتم تجنيد بروتينات إصلاح الحمض النووي لإهانة الحمض النووي في حين يزيد تركيزها محليا، وأنها تشكل مجموعات تسمى البؤر التي يمكن تصورها من قبل immunoflusorescence غير مباشر على عينات ثابتة. ويمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن بؤر البروتين، وكذلك لتحديد حجم التكلس الحالي في الخلايا.

وهذا يمكن أن يساعد في تفسير تسلسل الأحداث اللازمة لتشكيل معقدة وإصلاح الحمض النووي. يمكن أن تنطوي على تفاعلات بروتينية معينة من مثل هذه التجارب. وسوف يكون إثبات الإجراء باربرا دي لا بينا، صورة Postdoc الموهوبين جدا من مختبري بيغن من خلال زيادة 40، 000 خلايا هيلا في كل أكثر من 12 لوحة جيدا مع 18 ملليمتر الزجاج جولة يغطي إلى 80٪التقاء.

بعد تعريض الخلايا لاشععة غاما الرمادية، وغسلها مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم إزالة برنامج تلفزيوني تماما وإضافة 200 ميكرولترات من بنك التنمية الوطني إلى كل بئر. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة NDB.

ضع في اعتبارك أن وقت الحضانة يمكن أن يختلف باختلاف خط الخلية ، ولكن يجب ألا يتجاوز ذلك دقيقتين. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم إزالة برنامج تلفزيوني تماما وإضافة 200 ميكرولترات من 4٪ PFA إلى كل بئر لتثبيت الخلية.

احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. ثم إزالة PFA وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل بئر. إزالة برنامج تلفزيوني تماما ثم إضافة 200 ميكرولترات من محلول حجب لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو 16 إلى 18 ساعة في أربع درجات مئوية.

تمييع الجسم المضاد الأساسي و عازلة التخفيف ودوامة ذلك حتى مختلطة بشكل جيد في مربع الرطوبة وهنا قطعة من البارا فيلم وإضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية في قطرة واحدة. محاذاة حافة واحدة من غطاء من البئر مع قطرة وخفض ببطء على parafilm نشر السائل. احتضان الغطاء لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد حضانة غسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة واحدة لكل غسل. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية و عازلة التخفيف ودوامة ذلك حتى مختلطة جيدا تطبيق 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية لكل غطاء كما هو موضح سابقا واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. غسل الغطاء زلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع الماء لمدة دقيقة واحدة لكل غسل.

ثم جبلها على الشرائح الزجاجية مع تصاعد الغليسر القائمة على وسائل الإعلام التي تحتوي على غطاء ختم DAPI زلات مع طلاء الأظافر شفافة والسماح لهم الجافة لمدة 20 دقيقة. ضع قطرة من زيت الغمر على عدسة 60 × الهدف واستخدام DAPI لتحديد موقع النوى من خلال العدسة للحصول على صورة XYZ ، وفتح برنامج اقتناء وتعيين نوع الماسح الضوئي كما galvano نوع الماسح الضوئي كما جولة و512 من حجم الصورة 512. في وضع مجموعة لوحة PMT إلى متوسط VBM إلى الإطار والمسح التسلسلي إلى سطر.

تعيين المقبل صبغ والكشف عن الحرارة تعيين قناة واحدة لDAPI وSD واحد، والقناة الثانية لs alexafluor 488 وHSD ثلاثة، والقناة الثالثة إلى alexafluor في 647 وHSD أربعة حدد على Z.To ضبط الصورة الحية، والضغط على زر العيش على النافذة الحية وضبط التركيز. ثم استخدم نافذة أداة PMT لتعيين حساسية كثافة الليزر ، والمكاسب والازاحة للحصول على رصة z ، حدد البدء إلى النهاية و 15 شريحة. حدد المجلد لحفظ الصور واضغط على الزر ابدأ LSM لبدء الحصول على.

عند الانتهاء، اضغط على زر سلسلة القيام به لإكمال الحصول على الصورة. افتح برنامج التحليل ثم اضغط على نافذة أداة الدفعة وحدد الصور لتحليلها. انتقل إلى نافذة أداة التحليل وحدد الإسقاط، الذي سيعرض إسقاط الحد الأقصى للكثافة من 15 شريحة.

ضمن إعداد إخراج الإدخال، حدد مجلد المجموعة والإخراج الذي تم إنشاؤه. اضغط على عملية معالجة الصور وتصدير الصور كملفات TIFF. تنفيذ القياس الكمي النووي باستخدام cellprofiler وفقًا لتوجيهات المخطوطات.

خلايا لا يعالج مع الإشعاع يحمل جدّا قليل من غاما ه 2AX معرض علامة. في حالة عدم وجود بروتينات إصلاح الحمض النووي الأساسية، يمكن ملاحظة تراكم غاما H2AX عند فواصل الحمض النووي. تراكم فواصل غير مُرَدَّد يمكن أن يؤدي الخلايا إلى أن تصبح ما قبل الهابة التي تشير إليها نوىات غاما H2AX الصلبة.

وبعد التشعيع، تعرض نوى عدداً كبيراً من الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي يتم فيها تحديد صبغة غاما H2AX بسرعة كبيرة. في حين أن عدد بؤر قليلة إن وجدت لوحظ في غياب الإشعاع تم تحديد عدد البؤر في واحد اثنين أربع و 16 ساعة بعد الإشعاع وللتحكم في الإشعاع NOA. اعتمادا على المسألة البيولوجية التي أثيرت ونوع البيانات المطلوبة، وينبغي النظر في خيارات رسم مختلفة يمكن التحقيق في الكولوكولوجية من قبل الأجسام المضادة الأولية متعددة التي أثيرت في مختلف أنواع الحيوانات واستخدام الأجسام المضادة الثانوية، وصفت مع الفلوروفوريس متميزة.

تراكب الأخضر والأحمر، يؤدي إلى النقاط الساخنة الصفراء، والبروتينين من الفائدة موجودة في نفس بكسل. ويمكن تحقيق التحليل الكمي لتكلس الكولوكية عن طريق نهج قائم على الكائن أو عن طريق نهج إحصائي يقوم على تحليلات معامل ارتباط الكثافة. ويمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في أنواع الحيوانات المختلفة في هذا البروتوكول.

تأكد من أن الأجسام المضادة متوافقة ولن تتداخل مع بعضها البعض. تحتاج إلى تعيين بشكل مناسب الأجسام المضادة الثانوية لاستخدامها ضد كل من الأجسام المضادة الأولية والنظر في تداخل طيفي معين عند اختيار أقل قوة لاستخدامها. التكلس أو البروتينات تشير إلى التفاعلات المباشرة المحتملة.

ويمكن التحقق من ذلك عن طريق هطول الأمطار الحبيبية في الخلايا، أو عن طريق اخماد مباشرة باستخدام البروتينات النقية في المختبر.