9,893 Views
•
07:55 min
•
June 26, 2020
DOI:
Indirekt immunofluorescens gör det möjligt att upptäcka DNA reparation proteiner, bilder av rumsliga och tidsmässiga rekrytering och det hjälper förhöra Proteinprotein interaktioner på platsen för DNA-skador. Efter DNA-skador rekryteras DNA-reparationsproteiner till DNA-förolämpningen medan deras koncentration ökar lokalt, och de bildar grupper som kallas foci som kan visualiseras genom indirekt immunofluorescens på fasta prover. Denna teknik kan användas för att detektera proteinfoci, samt för att kvantifiera colocalization av nuvarande i celler.
Detta kan hjälpa till att förklara händelseförloppet som krävs för komplex bildning och för DNA-reparation. särskilda proteinproteininteraktioner kan medföras av sådana experiment. Demonstrera förfarandet kommer att Barbara De La Pena, en mycket begåvad Postdoc Foto från mitt laboratorium Börja med att växa 40, 000 HeLa celler i varje väl över 12 väl platta med en 18 millimeter runt glas coverslip till 80% confluency.
Efter att ha exponerat cellerna för fyra grå gammabestrålning, tvätta dem två gånger med en milliliter PBS. Ta sedan bort PBS helt och tillsätt 200 mikroliter NDB till varje brunn. Inkubera cellerna i två minuter i rumstemperatur ta sedan bort NDB.
Tänk på att inkubationstiden kan variera beroende på cellinjen, men i allmänhet inte bör överstiga två minuter. Tvätta cellerna med en milliliter PBS. Ta sedan bort PBS helt och tillsätt 200 mikroliter på 4%PFA till varje brunn för cellfixering.
Inkubera cellerna i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Ta sedan bort PFA och tillsätt en milliliter PBS till varje brunn. Ta bort PBS helt och tillsätt sedan 200 mikroliter av blockerande lösning till varje brunn och inkubera cellerna i två timmar vid rumstemperatur eller 16 till 18 timmar vid fyra grader Celsius.
späd den primära antikroppen och utspädningsbufferten och virvel det tills väl blandat i en fuktighetslåda och här en bit parafilm och tillsätt 10 mikroliter av primär antikropp i en enda droppe. Rikta in ena kanten av täcket från brunnen med droppen och sänk den långsamt på parafilmen som sprider vätskan. inkubera täckslipet i två timmar i rumstemperatur.
Efter inkubationen tvätta locket glider tre gånger i PBS i en minut per tvätt. späd den sekundära antikroppen och spädningsbufferten och virvel det tills väl blandat applicera 10 mikroliter sekundär antikropp på varje täckslip enligt tidigare beskrivning och inkubera den i två timmar vid rumstemperatur skyddad från ljus. Tvätta överdraget glider tre gånger med PBS och en gång med vatten i en minut per tvätt.
Montera dem sedan på glasglas med ett glycerolbaserat monteringsmedia som innehåller DAPI-tätningslocksglir med genomskinligt nagellack och låt dem torka i 20 minuter. Placera en droppe nedsänkning olja på 60 x objektivet och använda DAPI för att lokalisera atomkärnor genom okularet för XYZ bild förvärv, öppna förvärvsprogramvaran och ställa in skannern typ som galvano skannern typ som roundtrip och 512 av 512 bildstorlek. I PMT panelen inställt läge till VBM genomsnitt till ram och sekventiell skanning till linje.
Nästa ställa in färgämnet och värme detektorer som kanal ett till DAPI och SD en, kanal två till alexafluor 488 och HSD tre, och kanal tre till alexafluor på 647 och HSD fyra välja på att Z.To justera live-bilden, tryck på live-knappen på live-fönstret och justera fokus. Använd sedan verktygsfönstret FÖR BETALNING för att ställa in laserintensitetskänslighet, förstärkning och förskjutning För z-stackar väljer du start till och 15 segment. Välj mappen för att spara bilder och tryck på LSM Start-knappen för att börja förvärva.
När du är klar, tryck på knappen serie gjort för att slutföra bilden förvärvet. Öppna analysprogramvaran tryck sedan på batchverktygets fönster och välj de bilder som ska analyseras. Gå till analysverktygsfönstret och välj projektion, som kommer att visa maximal intensitetsprojektion från 15 segment.
Under indatautdatainställningen väljer du den skapade batch- och utdatamappen. Tryck process för bilder som ska bearbetas och exportera bilderna som TIFF-filer. Utför kärnkalkifiering med cellprofiler enligt manuskriptriktningar.
Celler som inte behandlas med strålningen uppvisar mycket få gamma H2AX expotecken. I avsaknad av väsentliga DNA-reparationsproteiner kan gamma H2AX-ackumulering observeras vid DNA-brott. Ackumulering av oreparerade raster kan leda celler att bli pre hypoton indikeras av fasta gamma H2AX kärnor.
Efter bestrålning uppvisar atomkärnor ett stort antal dubbla strandade raster som gamma H2AX lokalisera är extremt snabbt. Medan få om några högborgar observeras i avsaknad av en strålning antalet högborgar kvantifierades på en två fyra och 16 timmar efter en strålning och för NOA strålningskontroll. Beroende på den biologiska frågan upp och vilken typ av data som krävs, bör olika plottning alternativ betraktas Colocalization kan undersökas genom multiplexering primära antikroppar upp i olika djurarter och med hjälp av sekundära antikroppar, är märkta med distinkta fluorophores.
Superposition av grönt och rött, ger upphov till gula hotspots, de två proteiner av intresse finns i samma pixlar. Kvantitativ analys av colocalization kan uppnås genom ett objekt baserat tillvägagångssätt eller genom en statistisk metod som utför intensitet korrelationskoefficienten baserade analyser. En kombination av primära antikroppar upp i olika djurarter, kan användas i detta protokoll.
Se till att antikropparna är kompatibla och kommer inte att störa varandra. Du måste på lämpligt sätt ställa in den sekundära antikroppen som ska användas mot var och en av de primära antikropparna och överväga en viss spektral överlappning när du väljer den färre kraft som ska användas. Colocalisation eller proteiner indikerar möjliga direkta interaktioner.
Detta kan verifieras genom granulär fällning i celler, eller genom direkt lägga ner med hjälp av renade proteiner in vitro.
Efter DNA-skador aktiverar mänskliga celler viktiga reparationsvägar för att återställa deras arvsmassa. Här beskriver vi metoden för indirekt immunofluorescens som ett sätt att upptäcka DNA-reparationsproteiner, analysera deras rumsliga och tidsmässiga rekrytering och hjälpa till att förhöra protein-protein interaktion på platserna för DNA-skador.
Read Article
Cite this Article
de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).
Copy