Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kärnorolering från helvävnad med hjälp av ett rengöringsmedel och enzymfri metod
Chapters
Summary June 24th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Enda atomkärna isolering bygger på dissociation och tvättmedel-baserade permeabilisering av cellmembranet, steg som behöver optimering och är benägna att införa tekniska artefakter. Vi visar ett tvättmedel och enzym-fria protokoll för snabb isolering av intakt kärnor direkt från hela vävnaden, vilket ger kärnor lämpliga för single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.
Transcript
Förbereda en enda cell eller enstaka kärnor suspension är ett kritiskt steg för hög genomströmning transkriptom och epigenome profilering. Vårt protokoll ger en enkel, reproducerbar, och universell metod för enkel kärnor isolering. I motsats till andra metoder som kräver tvättmedel för kärnor isolering, är vårt protokoll kolumn-baserade, som är tvättmedel och enzym-fri.
Det möjliggör kärnor isolering på mindre än 30 minuter. Vårt protokoll förenklar nuklei-isoleringen. Det ger en robust metod för att förbereda enstaka kärnor suspension från svåra att dissociate vävnader.
Till att börja med, pre-chill buffert A och B från en tvättmedel-fri kärnor isolering kit genom att placera dem på is i minst 30 minuter. Coat rör och pipett tips med 5%BSA lösning, som kommer att öka återvinning av atomkärnor. För att belägga pipettspetsarna, pipettera 5%BSA-lösning två till tre gånger och lufttorka dem i två timmar.
För att belägga rören, fyll dem med BSA och invertera dem tre gånger. Ta bort lösningen och lufttorka rören upp och ner på ett rent mjukpapper i två timmar. Coat en samlingsrör och en 1,5 milliliter tub per prov.
Använd forceps för att försiktigt bryta upp skallen och ta bort mjuka vävnader, hud och ben från de ventrala och dorsala sidorna av skallen. Sedan försiktigt överföra hjärnan till en 30 millimeters maträtt som innehåller iskall PBS och hacka hjärnan i små bitar med hjälp av ett rakblad. För att isolera enstaka kärnor, överför den malda vävnaden till filterpatronen som finns i isoleringssatsen för kärnor och avlägsna överflödig lösning och tillsätt 200 mikroliter av kallbuffert A.Slipa vävnaden med en plaststav i två minuter.
Tillsätt 300 mikroliter kallbuffert A till filterpatronen och inkubera den på is med locket öppet i 10 minuter. Sedan locket patronen och återanvända vävnaden genom att vända röret fem gånger. Centrifugera provröret vid 16, 000 gånger g i 30 sekunder för att brista cellerna.
Genomflödet innehåller intakta kärnor, som bildar en färglös pellet i botten av röret. Kassera filtret och sedan återanvänd pelleten genom att virvel kraftigt i 10 sekunder. Pellet kärnorna igen genom att centrifugera lösningen vid 500 gånger g i tre minuter.
Sedan försiktigt kasta supernatanten. Resuspend pelleten i 0,8 milliliter av kall buffert B genom pipettering två till tre gånger och centrifug kärnorna på 600 gånger g i 10 minuter, som kommer att skilja dem från membranet skräp. Kassera supernatanten försiktigt.
Resuspend den isolerade atomkärnor i 500 mikroliter av PBS med 5%BSA och hålla suspensionen på is tills FACS. För att bekräfta kärnmorfologi med HEX-färgning, överför 100 mikroliter av den enda kärnor suspensionen till ett nytt rör med hjälp av BSA belagda tips. Stain kärnorna genom att lägga till 0,1 mikroliter av HEX och försiktigt virvelning röret.
Överför atomkärnor suspensionen till en glas botten skålen och bild av atomkärnor med hjälp av en fluorescens mikroskop med en laser excitation inställning av 405 nanometer. Innan du utför FACS, filtrera atomkärnorna med en 40 mikrometer cell sil i en BSA belagda röret. Späd den filtrerade upphängningen genom att addera PBS med 5%BSA till en slutlig volym på 1, 000 mikroliter.
Märk två runda botten-FACS-rör som kontroll och färgas och överföra 250 mikroliter av kärnor suspensionen i kontrollröret med hjälp av en BSA-belagd pipett spets. Överför de återstående 750 mikroliter av lösningen till FACS röret märkt färgade och tillsätt en mikroliter AV HEX färgämne att färga atomkärnor. Blanda det sedan genom långsam virvelning.
Ladda det ej besvakna kontrollprovet i cellsorteraren och spela in 5, 000 händelser. Ladda sedan det färgade provet och spela in 5, 000 händelser. Rita FACS-portar för identifiering av enstaka kärnor.
Kärnor kan väljas genom att jämföra HEX-lysrörssignalen mellan reglaget och färgade prover. Sortera sedan HEX-positiva kärnor från det färgade röret till ett nytt 1,5 milliliterrör som innehåller 50 mikroliter PBS med 5%BSA. Detta protokoll användes för att generera enda kärnan suspension direkt från zebrafish hjärnvävnad.
De isolerade atomkärnor var färgas med HEX och visualiseras med fluorescence mikroskopi. De verkade intakta, runda och väl åtskilda. Viktigt, kärnkraft aggregering var frånvarande.
Anrikning av isolerade atomkärnor utfördes med flödescytometri genom gating på förekomsten av en HEX fluorescerande signal. Unstained kärnor visas bakgrund fluorescens medan färgade kärnor uppvisade stark fluorescens signal. De obefläckade och färgade atomkärnor var väl segregerade i den violetta kanalen.
Medan du försöker detta protokoll, det är viktigt att komma ihåg att enskilda kärnor tenderar att hålla sig på ett plastmaterial. För att förhindra den potentiella förlusten av kärnor och öka effektiviteten rekommenderas det starkt med grundbeläggning av plastmaterialet. Isolerade enda kärnor suspension kan ytterligare utnyttjas för enstaka kärnor RNA Denna teknik belysa cellulära heterogenitet i komplexa biologiska system och hjälpa till att definiera cell subtyper och nätverk gen.
Med hjälp av en tvättmedel och enzymfri metod registrerar det tekniska buller och bias som infördes under provberedningen. Denna metod har utvecklat en förenklad och logistisk enda kärnor isolering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
