Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifiera spontana Ca2 + flussmedel och deras nedströms effekter i Primär Mus Midbrain Nervceller
Chapters
Summary September 9th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta in vitro Ca2 + flussen i midbrain nervceller och deras nedströms effekter på caspase-3 med hjälp av primära mus midbrain kulturer. Denna modell kan användas för att studera pathophysiologic förändringar relaterade till onormal Ca2 + aktivitet i midbrain nervceller, och att skärmen nya therapeutics för anti-apoptotiska egenskaper.
Transcript
Detta protokoll kvantifierar kalcium flussmedel i dopaminerga nervceller, som går förlorade vid Parkinsons sjukdom. Detta är användbart för att förstå hur onormalt kalcium orsakar dopaminerga neuron förlust vid Parkinsons sjukdom. För första gången visar vi spontana kalcium fluxes i odlade primära mellanhjärnan nervceller.
Denna metod kan användas för att dissekera specifika receptor bidrag som deltar i kalcium-medierad apoptos. Vår metod ger en väg för hög innehållshalt drog skärmar för att upptäcka specifika och effektiva neuroprotektiva föreningar för Parkinsons sjukdom. Dessa neuroprotektiva föreningar skulle förhindra kalcium-medierad apoptos i dopaminerga neuron.
Börja med att förbereda en milliliter av serumfritt DMEM-medium med en mikroliter av hSyn-GCaMP6f AAV per fat. Aspirera cellodlingsmediet från varje fat och ersätt det med en milliliter av det preparerade DMEM med hSyn-GCaMP6f. Placera disken tillbaka till 37 grader Celsius inkubator i en timme.
Efter inkubationen aspirera du mediet med AAV och ersätt det med tre milliliter cellodlingsmedium. Inkubera disken vid 37 grader Celsius i fem till sju dagar. Ändra mediet varannan till tre dagar under hela denna period av virusinfektion.
Förbered en liter av HEPES-inspelningsbufferten, 200 milliliter av 20 mikromolar glutamatinspelningsbuffert och 200 milliliter av 10 mikromolar NBQX-inspelningsbuffert enligt manuskriptriktningar. Fyll en steril 35 millimeter petriskål med tre milliliter av inspelningsbufferten. Ta petriskålen med de infekterade kulturerna från inkubatorn, ta sedan försiktigt tag i kanten av en täcksli med fina spetstippar och överför den till skålen med inspelningsbufferten.
Placera den återstående locket glida i medium tillbaka i 37 grader Celsius inkubatorn och transportera skålen med inspelning buffert till confocal mikroskop. Starta bildhanteringsprogrammet. Medan det är initiering, starta peristaltic pumpen och placera linjen i inspelningen buffert.
Kalibrera sedan flödet till två milliliter per minut. Överför den infekterade täckslien från petriskålen till inspelningsbadet med fina typpor. Med hjälp av 10X vatten nedsänkning objektiv och brightfield ljus, hitta planet av fokus och leta efter en region med en hög densitet av neuron cell organ, sedan byta till 40X objektiv och fokusera provet.
Välj och tillämpa AlexaFluor 488 i fönstret Dyes list. För att förhindra överexponering och fotoblekning av fluorforerna, börja med låga HV- och lasereffektinställningar. För AlexaFluor 488-kanalen, ställ in HV till 500, förstärkningen till 1x och förskjutningen till noll.
Ställ in strömmen till 5%för 488 laserlinjen. Öka pinholestorleken till 300 mikrometer och använd alternativet för fokus x2-skanning för att optimalt justera emissionssignalerna till delaturationsnivåer. Inställningar kan sedan justeras för optimal synlighet av varje kanal.
När mikroskopinställningarna har optimerats flyttar du scenen för att lokalisera en region med flera celler som visar spontana förändringar i GCaMP6f-fluorescensen och fokuserar på det önskade planet för avbildning. Använd verktyget Clip rect för att klippa bildrutan till en storlek som kan uppnå ett ramintervall på knappt en sekund. Ställ in intervallfönstret på värdet 1,0 och Num-fönstret till 600.
Om du vill fånga en t-seriefilm väljer du alternativet Tid och använder sedan Xyt-skanningsalternativet för att påbörja bildtagningen. Titta på imaging förloppsindikatorn och flytta linjen från HEPES-inspelningsbufferten till 20 mikromolarfrostmatinspelningsbufferten vid lämplig tidpunkt. När bildtagningen är klar väljer du knappen serie klar och sparar den färdiga t-seriens film.
Fortsätt att granska glutamat i ytterligare fem minuter så att kulturen av nervceller har utsatts för glutamat i totalt 10 minuter. Upprepa denna process för varje omslagssli som ska avbildas. Det är möjligt att visa kalcium spår och neuronala cellkroppar omedelbart efter experimentet.
Använd Ellipse verktyget för att dra önskat antal ROIs runt neuronal soma. Och använd knappen Serieanalys för att visualisera spåren. Efter den ytterligare fem minuters exponering för glutamat, ta bort locket slip från badet med fina tärnor och placera tillbaka den i Petri-skålen med inspelningen buffert tills all bildbehandling är klar.
På dagen för bildbehandling, vm-kulturerna behandlades med antingen glutamat eller en kombination av glutamat och NBQX. I båda villkoren observerades heterogena och spontana förändringar i GCaMP6f florescence som indikerar spontana kalcium flussen. Tillämpning av glutamat genereras en robust och ihållande kalcium svar i både spontant aktiva och quiescent nervceller.
Tillämpning av NBQX minskad spontan aktivitet, och delvis blockerade glutamat svaret. I vilken utsträckning glutamat ansökan stimuleras ett kalcium svar i varje villkor kvantifierades med hjälp av området under kurvan, topp amplitud och latens att svara. Latensen till svar ökade under villkoret NBQX och glutamat.
För att mäta glutamat-medierad apoptos, var cellerna fasta och färgas med en anti-Caspase-3 antikropp. Genomsnittlig caspas-3-intensitet var signifikant högre vid båda behandlingstillstånden jämfört med obehandlade kontroller. En mer grundlig analys av upphetsade toxisk celldöd kan göras genom att räkna antalet immunostain tyrosin hydroxylase positiva dopaminerga nervceller i kontroll och glutamat behandlade tillstånd.
Denna teknik har banat väg för att förstå de relativa bidragen från olika receptorer och järnkanaler som är involverade i kalciummedierad apoptos i dopaminerg neuron.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
