Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Udforskning af fedtvævsstruktur ved methylsalicylatclearing og 3D-billeddannelse
Chapters
Summary August 19th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en enkel, billig og hurtig clearing metode til at løse 3D-strukturen af både mus og humanhvidt fedtvæv ved hjælp af en kombination af markører til at visualisere vaskulatur, kerner, immunceller, neuroner, og lipid-dråbe pels proteiner ved fluorescerende billeddannelse.
Transcript
Denne protokol tillader analyse af tre-dimensionelle struktur meget store menneskelige på mus fedtvæv ballet mikroskopi. Lette sammenkok af patologisk dysfunktion med fedtvæv strukturelle ændringer. Denne clearing proces er meget enkel, meget godt tilpasset til clearing mennesker på varme mus fedtvæv og bruge mindre giftige opløsningsmiddel såsom ethanol eller methyl salicylat i forhold til andre klare protokoller.
Begynd med at nedsænke den høstede mus eller humane hvide fedtvæv i mindst 10 milliliter 4% effekt formaldehyd i PBS i en 15 milliliter plastrør fortrinsvis under en kemisk hætte. Vævet rystes på en rulleplade ved stuetemperatur i en time, før røret overføres til en rulleplade ved fire grader Celsius natten over. Næste morgen skylles det faste hvide fedtvæv i 10 milliliter PBS i fem minutter ved stuetemperatur for at fjerne alle spor af fiksativ og overføre vævet til et 15 milliliterrør indeholdende 10 milliliter 0,3 % glycin i PBS i en times inkubation ved stuetemperatur på en orbitalshaker ved 100 omdrejninger i minuttet.
Når de resterende frie aldehydgrupper er blevet slukket, nedsænkes vævet i et 15 milliliterrør indeholdende 10 milliliter 0,2% Triton X-100 i PBS i en to timers inkubation med rystelser ved 37 grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen behandles vævet med 10 milliliter på 0,2 % Triton X-100 og 20% DMSO med omrystning ved 37 grader Celsius natten over. Næste morgen nedsænkes vævet i et 15 milliliter plastrør indeholdende 10 milliliter 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 0,1% deoxycholate og 20% DMSO i PBS i mindst 24 timers inkubation ved 37 grader Celsius med rystelser.
Ved slutningen af inkubationen skylles vævet med 10 milliliter 0,2% Triton X-100 i PBS på en orbital shaker ved 100 omdrejninger i minuttet i en time. Efterfulgt af nedsænkning i 15 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i 12 timer ved 37 grader Celsius med omrystning. For farvning af det hvide fedtvæv.
Vævet overføres til 300 mikroliter på 0,2 % Triton X-100, 10%DMSO og 3%BSA i PBS suppleret med de primære interesseantistoffer i et 1,5 milliliter mikrorør beskytter det mod lys med aluminiumsfolie og placerer røret i et 50 milliliter Falcon-rør. Placer røret i orbital shaker for en to dages inkubation ved 37 grader Celsius med omrystning. Ved slutningen af inkubationen skylles vævet to gange i 10 milliliter 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med omrystning og beskyttelse mod lys.
Efter den anden skylning vaskes vævet i 10 milliliter frisk 0,2 %Triton X-100, 10%DMSO og 3%BSA og PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med omrystning Derefter overføres vævet til et 1,5 milliliterrør indeholdende 300 mikroliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS, suppleret med de relevante sekundære antistoffer og beskytte røret mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie. Efter en to dages inkubation ved 37 grader Celsius på en shaker, vaskes vævet to gange i 10 milliliter 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med rystelser beskyttet mod lys. Efter den anden vask skylles vævet i et rør, der indeholder 10 milliliter frisk 0,2 %, Triton X-100, 10%DMSO og 3%BSA i PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med omrystning og lysbeskyttelse.
Efterfulgt af en to timers vask i 10 milliliter PBS alene ved 37 grader Celsius med omrystning og lysbeskyttelse. For vævsrydning af hvidt fedt i slutningen af PBS-vasken nedsænkes vævet og 10 milliliter af en stigende ethanolkoncentrationsserie i en to timers inkubation pr. koncentration ved stuetemperatur med omrystning beskyttet mod lys som angivet. Den næste morgen nedsænkes vævet i en 20 milliliter glasflaske med en plastik hætte indeholdende fem milliliter methyl salicylate i en røghætte.
Det hvide fedtvæv er stadig tydeligt på nuværende tidspunkt. Beholderen rystes mod lys ved stuetemperatur i mindst to timer. Den hvide fedtvæv bliver helt transplantation.
For 3D konfokale billeddannelse af de farvede og ryddet hvide fedtvæv montere en metallisk billeddannelse kammer udstyret med en glasbund og i en røghætte overføre vævet til kammeret. Fyld kammeret med frisk methylsalicylat. Færdiggøre montering af kammeret ved at tilføje en lille dækning slip for at stabilisere vævet og en stor dækning slip for at lukke kammeret.
Placer kammeret på en omvendt konfokal mikroskop fase for væv billeddannelse ved lav forstørrelse til at generere et par kubikcentimeter 3D kort over hele fedtvæv prøve. Efter 3D-kortgenerering skal du bruge et 20x langdistanceluftmål, der giver et godt forhold mellem opløsning og dybde til at vælge flere områder til vævsprøvetagning ved en højere forstørrelse. Til cellesegmentering skal du konvertere 3D-stakke til softwareformatet for at frigøre hukommelse.
Før du åbner softwarens cellemodul. Skift indstillingen for celledetektion til plasmamembranfarvning, og vælg fluorescerende kanal for den markør, der bruges til at afgrænse celleperiferiet. Konfigurer derefter tærsklerne, angiv et interval af de forventede cellestørrelser, og kør segmenteringen.
De påvirker af clearing på menneskelige og mus hvide fedtvæv kan observeres med det blotte øje. Clearing også drastisk forbedrer billedet dybden af det væv, der er i stand til at blive erhvervet. Og letter hele væv 3D-billedbehandling og 3D-kort generation ud af 4X Forstørrelse.
3D-kortlægning gør det yderligere muligt at vælge forskellige interesseområder, der skal erhverves ved en 20X forstørrelse til en dybde på to millimeter. Specifikke farvning af lipid dråber og adipocytter kan opnås ved hjælp af perilipin og anti-GLUT4 antistoffer henholdsvis. Blodkarrene kan påvises ved hjælp af enten CD31 antistof eller intravenøs injektion af Lectin DyLight 649 kort før ofring.
Makrofager og T-celler kan visualiseres ved hjælp af anti CD301 phycoerythrin antistof og anti TCR beta Pacific blå antistof. Den perifere nerve netværk kan påvises ved hjælp af anti tyrosin Hydroxylase antistof. Ved hjælp af disse mærkninger den gennemsnitlige størrelse og størrelse fordeling af adipocytter og blodkar netværk tæthed i fedtvæv kan derefter bestemmes.
Det er afgørende at følge besættelse tid som påvist, fordi dårlig prøve forberedelse ikke vil resultere i en god billedkvalitet. Denne protokol kan kombineres med avanceret billedbehandlingssystem eller kan kobles til efterbehandling billedanalyse freeware.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
