Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Trata-se de um método barato que combina as vantagens da inflação do ar e da fixação da perfusão vascular para a preservação dos pulmões para análises estruturais e funcionais. A principal vantagem dessa técnica é a preservação da morfologia celular e localização dentro dos espaços aéreos do pulmão. Deve-se tomar cuidado ao colocar o adaptador de isca na traqueia e a agulha de perfusão no ventrículo direito para garantir a inflação e fixação adequadas.

Para configurar o aparelho de inflação do ar, coloque uma seringa para a coluna de água em um suporte de anel e meça uma altura vertical de 25 centímetros da plataforma animal até 25 centímetros na coluna de água. Conecte-se à extremidade do tubo da coluna de água à torneira na câmara de ar e conecte um tubo da isca feminina da câmara de ar à torneira do recipiente de processamento de animais. Confirme que a tampa da câmara de ar e a torneira do lado de fora do recipiente de processamento de animais estão fechadas, e que a torneira na tubulação que leva da coluna de água para a câmara de inflação do ar está aberta.

Em seguida, encha a seringa com água até a marca de 25 centímetros. A água fluirá através da seringa e da tubulação para a câmara de ar. Uma vez que a pressão é igualada, a água vai parar de fluir.

Para preparar os pulmões para a inflação faça uma incisão lateral na parede abdominal abaixo da caixa torácica do rato eutanizado, e uma segunda incisão lateral da parede abdominal acima dos quadris. Corte ao longo da linha média da incisão interior em direção à incisão superior, e use uma tesoura sem corte para fazer cuidadosamente uma incisão no lado lateral do diafragma. Os pulmões devem entrar em colapso assim que o diafragma for perfurado.

Corte transversalmente ao longo do diafragma para abrir a cavidade torácica e corte superiormente ao longo do esterno do processo xifoide até o entalhe do malabarista, e lateralmente acima da caixa torácica para expor totalmente o coração e os pulmões. Fixar os lados da caixa torácica e fazer uma incisão no pescoço, acima da traqueia. Remova a pele, músculo, glândula tireoide e tecido conjuntivo ao redor da traqueia e use fórceps curvos para deslizar dois pedaços de sutura sob a traqueia posterior.

Use um pedaço de sutura para segurar o adaptador de isca de inflação no lugar e use um medidor de 18 por uma agulha de polegada para fazer um pequeno furo na traqueia. Insira um adaptador de isca de 20 bitolas no orifício e amarre a sutura ao redor da traqueia imediatamente distal para onde o adotante da isca entra no orifício. Em seguida, transfira o animal para o recipiente de processamento de animais e conecte o adaptador de isca à isca feminina no interior do recipiente de processamento animal.

Para inflar os pulmões, coloque o medidor de 25 por agulha de 5/8 polegadas presa ao aparelho de perfusão no ventrículo direito do coração e corte a aorta abdominal para permitir que o sangue escorra do coração e promova o fluxo de perfusato através dos pulmões. Abra a torneira do lado de fora do recipiente de processamento de animais e infle os pulmões a 25 centímetros de água por cinco minutos, enquanto cuida que o nível de água na seringa não diminua muito rapidamente. Durante o último minuto da inflação pulmonar, ligue a bomba peristáltica para uma taxa de fluxo de 10 mililitros por minuto.

A solução de heparina deve fluir da garrafa através da tubulação para o animal. Depois de inflar os pulmões por cinco minutos, desligue a bomba e mude o perfusado da heparina para fixação. Abaixe a seringa da coluna de água para 20 centímetros.

É normal que bolhas de ar se movam dentro da coluna de água à medida que a pressão muda. Verifique o nível da água na seringa. Deve estar na marca de 25 centímetros.

Em seguida, espere um minuto para permitir que os pulmões desintroem de 25 a 20 centímetros de pressão da água antes de reiniciar a bomba a uma taxa de fluxo de 6,5 mililitros por minuto por minuto por 10 a 15 minutos, perfusão vascular fixa. Para a extração do tecido pulmonar inflado e fixo, amarre firmemente o segundo pedaço de rosca ao redor da traqueia, distal ao adaptador de isca, e remova o adaptador de isca da traqueia. Remova a agulha do coração e use uma tesoura sem cortes para cortar o tecido conjuntivo, posterior ao mediastino, para libertar os pulmões e o coração da cavidade torácica torácica tomando cuidado para evitar perfurar os pulmões.

Remova cuidadosamente o coração dos pulmões e coloque os pulmões em 20 a 25 mililitros de fixação em um tubo cônico de 50 mililitros. Puxe a sutura segurando a traqueia através da abertura no tubo cônico e fixe a sutura pelos fios da tampa. Em seguida, inverta o tubo para garantir que os pulmões flutuantes inflados pelo ar permaneçam totalmente submersos em fixação e processem os pulmões para estudos histológicos de acordo com os protocolos padrão.

Quando o diafragma é introduzido durante a dissecção, a integridade do espaço pleural será abolida e os pulmões devem entrar em colapso. Após a aplicação de 25 centímetros de pressão da água, o ar entrará nos pulmões através da traqueia e a inflação deve ser facilmente observada. Uma vez que os pulmões se expandiram totalmente, a pressão da inflação pode ser reduzida para 20 centímetros para manter os pulmões inflados sem excesso de destessão.

Os pulmões devem permanecer inflados após a ligadura traqueal e a remoção do tórax. A deflação pode ocorrer se os pulmões forem perfurados durante a preparação animal ou extração pulmonar. A análise histológica das seções pulmonares infladas revela que muito poucas células imunes estão presentes no lúmen das vias aéreas de tecidos fixos usando a inflação tradicional baseada em líquido.

Em contraste, as células inflamatórias são preservadas dentro dos espaços aéreos de tecidos fixados via perfusão vascular com a inflação do ar. Após a inflação do ar com fixação de profusão, o tecido pulmonar pode ser incorporado em formalina para seção de tecidos e análises subsequentes através de técnicas de histologia, incluindo coloração, imunohistoquímica e imagem imunofluorescente.