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一种人外周血淋巴细胞γ-H2AX病灶测定的自动显微镜评分方法
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Summary December 25th, 2021
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该协议介绍了外周血淋巴细胞上γ-H2AX病灶测定的载玻片制备和自动评分。为了说明测定的方法和灵敏度，在 体外照射分离的淋巴细胞。这种自动化的DNA DSB检测方法对于快速和高通量的生物剂量测定应用非常有用。
Transcript
我的名字是Shankari Nair博士，我是nRF核医学系放射生物物理学部的博士后研究员，iThemba LABS。在本视频中，我们将演示在人外周血淋巴细胞上使用自动γ H2AX病灶测定，以用于批量对称应用。严格控制人员的辐射风险。
电离辐射通过诱导DNA断裂直接影响DNA的结构。特别是双股断裂。DNA双链断裂识别过程中最早的步骤之一是组蛋白变体H2AX的磷酸散射和修复蛋白的募集。
本视频将概述使用显微镜使用自动玻片扫描系统和分析平台对Gamma-H2AX病灶人核的数量进行评分，并集成荧光显微镜。淋巴细胞从全血中分离出来。用PBS以一比一的比例稀释全血，然后将稀释的血液轻轻地放在一体积的密度梯度培养基上。
通过将管子倾斜45度逐渐分层。将悬浮液转移到离心机中，在900 G下在室温下旋转20分钟，离心后将形成四层。小心地将含有淋巴细胞的浑浊层转移到新的无菌锥形管中。
用PBS洗涤淋巴细胞并使用血细胞计数器计数。一旦确定了淋巴细胞的总数，将淋巴细胞和悬浮液稀释至一毫升完全RPMI中约800，000个淋巴细胞的浓度。样品和准备我们的辐射。
淋巴细胞用来自钴60源的伽马射线照射，然后在加湿的5%二氧化碳培养箱中在37摄氏度下孵育一小时。对于每个照射条件或管，准备三张载玻片。将幻灯片放入夹持器中，然后是滤镜卡，最后是漏斗。
固定玻片夹并放入细胞离心机中。将250微升细胞悬浮液加入每个漏斗中，旋转30 G五分钟。细胞离心机的使用对于在载玻片自动化上获得标准化条件至关重要。
旋转后，从夹子中取出载玻片，然后使用疏水笔，在细胞所在的位置周围画一个圆圈。现在已经制作了载玻片，需要将细胞固定在载玻片上，以便可以进行免疫荧光染色。使用3%多聚甲醛或PFA和PBS溶液固定细胞20分钟。
固定后，在装有PBS的Coplin罐中洗涤载玻片五分钟。然后，用Triton X覆盖细胞以允许通透性。通透化步骤去除更多的细胞膜脂质，使抗体进入细胞核内部。
从这里开始，我们使用PBS中1%BSA制成的封闭溶液来洗涤载玻片，以减少潜在的非特异性结合。用1%BSA和PBS洗涤10分钟后，载玻片在室温下与一至500个一级抗γ H2AX抗体在加湿室中孵育一小时，通过在矩形载玻片存储盒的底部添加湿纸巾轻松完成。与一抗孵育后，取出液体并在1%BSA溶液中再次洗涤载玻片。
在加湿室中用一到一千个稀释的二级驴抗小鼠TRITC抗体孵育载玻片一小时。在PBS中进行3次10分钟的洗涤之前，先取出抗体。用铝箔盖住Coplin罐，以防止在洗涤步骤期间暴露在光线下。
取出载玻片，并用无尘薄纸擦去疏水圈外的多余PBS。最后，添加一到两滴DAPI，导致默认安装介质，并用盖板滑移轻覆盖载玻片。确保没有滞留的气泡，然后将样品储存在四摄氏度的黑暗地方过夜。
用70%乙醇轻轻擦拭载玻片，并将载玻片放在自动扫描平台或载玻片台上，连接到ZED-2显微镜的zite轴向图像。选择 MetaCyte 选项卡下的分类设置以编辑分类器。选定的分类器将由系统用于扫描和评分载玻片，并且基于一组预定义的参数，这些参数将确定系统如何选择单元格并对焦点进行评分。
分类器可以根据许多预分类的图像字段进行优化和训练。根据显微镜的放大倍率、用于染色的类型和抗体，可以优化不同的分类器。因此，分类器通常因实验室而异，但我们将概述在必须调整分类器设置时要考虑的最基本步骤。
在Capture'选项卡下，可以找到将要使用的过滤器，这里是DAPI和TRITC，最大积分时间为1.04秒。后者基于该公司提供的原始分类器，后来针对这种特定细胞类型（即淋巴细胞）中的抗体强度和背景γ H2AX或TRITC信号进行了调整。在"曝光"选项卡下，定义了最小积分时间。
分类器将始终保持在最小和最大积分时间内，从而防止幻灯片过度曝光或曝光不足。在"单元格选择"选项卡下，根据所分析单元格的大小和形状定义最小和最大对象区域。例如，预先确定的凹度值和纵横比对于淋巴细胞是特异性的，淋巴细胞通常具有圆形。
在"特征"选项卡下，您可以更改图库和直方图视图，以及确定显微镜需要评分的内容。系统可以对许多项目进行评分，具体取决于用户选择的功能。例如，软件如何对单个对象进行评分的阈值。
确定合适的分类器后，在侧边栏中选择设置，并为每张幻灯片指定一个唯一的名称，然后选择相应的分类器。选择"最大细胞计数"，然后添加需要扫描的最大细胞数。即使所选搜索窗口尚未完全扫描，搜索也会在达到最大细胞计数后立即终止。
对于生物不对称应用，考虑到每个血液样品准备了三张载玻片，每张载玻片1000个细胞的自动评分就足够了。单击"确定"以确认设置。要扫描幻灯片，请在边栏中选择"搜索"。
如果在幻灯片设置中选择了"手动搜索窗口"设置，则对话框将打开一行以确定扫描区域。通过使用 10 倍物镜，通过鼠标左键单击固定搜索字段的两个角，以交互方式选择幻灯片上的矩形搜索区域。这可以通过"确定"按钮进行确认。
调整焦点开始位置。该软件将提示焦点并使用每张载玻片的40次物镜将参考核居中，并使用OK确认设置。系统将按顺序自动向所有侧面移动。如有必要，请调整此步骤的实时映像设置和集成时间。
检查所有显微镜设置。确保显微镜管的操纵杆处于将所有光线转移到照相机的位置，并使用"确定"确认系统提示。系统在最靠近参考场的网格位置启动网格自动对焦。它继续将字段聚焦在常规网格上，向搜索窗口的正面和背面蜿蜒移动。
网格自动对焦完成后开始扫描。舞台在蜿蜒的图案字段中移动，以捕获数据。当检测到细胞时，将定位该细胞，并存储图库图像并将其显示在屏幕中，并更新细胞计数。
如果已扫描整个搜索、已达到最大细胞计数或搜索已取消，则搜索将终止。扫描完成后，右键单击底部的栏并打开样品。查看库，其中包含检测到的细胞的小图像。
在此窗口中，您可以通过要从下拉菜单中选择的条件来指定存储在库中的单元格。单元格通常按检测到它们的顺序显示。单击质量直方图"或"特征值图"，给出检测到的细胞的分布，以及均值和评分焦点的标准偏差。
在这里，我们比较零灰度样本与1.5灰度样本。这通常是一张对照幻灯片，平均值为每个细胞0.124个焦点，其中细胞没有被照射。在生物不对称的背景下，这表明一个人没有暴露于高剂量辐射。
在图中，我们可以看到大多数细胞每个细胞的病灶几乎为零，并且没有正态分布的一面。当我们将其与1.5灰度的剂量进行比较时，可以清楚地看到这是一个辐照的样品。在生物不对称的背景下，这种正态分布是样品暴露于辐射的明显迹象。
自动扫描足够灵敏，可以检测低剂量下的焦点诱导。结果显示，随着剂量的增加，每个细胞的病灶数量明显线性增加。DNA双链断裂检测的自动化方法对于快速和高通量的生物不对称应用非常有用。
感谢您的收看。
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