3,100 Views
•
08:13 min
•
May 31, 2021
DOI:
Detta protokoll ger en enkel, snabb och reproducerbar metod för att inducera en skalbar trubbig kraft traumatisk hjärnskada hos vuxna zebrafiskar. Den vuxna zebrafisken som genomgår denna trubbiga kraft traumatiska hjärnskada uppvisar många av de egenskaper som observerats hos människor som lider av en trubbig kraft TBI. James Hentig och Kaylee Cloghessy, två doktorander från mitt laboratorium, demonstrerar.
Börja med att fylla en Petri-maträtt med modelleringslera. Använd sedan fingrarna eller baksidan av ett par tångar för att skapa en upphöjd plattform med ytterligare modelleringslera. Dela upp den upphöjda plattformen på längden i två ungefär lika stora halvor med ett rakblad.
Forma de två halvorna i en kanal, så att den rymmer längden på en vuxen fisk. Använd ytterligare lera för att bygga väggar för att säkra 2/3 av fiskkroppen med huvudet exponerat. Forma ett litet stöd i det exponerade huvudområdet vinkelrätt mot väggarna för att undvika rotation eller rekyl av huvudet vid skada.
Se till att kanalens sidor inte hindrar den nedlagda vikten. Använd en minihålslag för att skapa en 3-millimeters stålskiva från ett 22-gauge stål som blinkar. Placera en sövd fisk som inte svarar för att svans nypa på lerformen i kanalen med sin dorsala sida upp så att kroppen är säkrad på sidorna.
Placera den 3 millimeters 22-gauge stålskivan på huvudet, centrerad över önskad slagpunkt. Justera fisken vinkelrätt för att undvika att huvudet lutar åt ena sidan, vilket kan orsaka en ojämn inverkan. Använd ett standardringstativ och armklämma för att säkra stål- eller plastslangen, se till att den är rak, så att slangens botten är 1,5 centimeter över zebrafiskens huvud.
Titta ner i slangen för att säkerställa att den är justerad ovanför stålplattan. Välj lämpligt kullager baserat på önskad svårighetsgrad av skadan. Släpp kullagret från en förutbestämd höjd ner på slangen på stålplattan.
Placera sedan den skadade fisken i återhämtningstanken som ska övervakas. Fyll en Petri-skål med modelleringslera och skapa en liten hålighet för att stödja kroppen under dissekering. Placera fisken i lerformen med dorsalsidan uppåt.
Placera två dissekeringsstift, en genom mittlinjen halvvägs ner i kroppen och den andra cirka 5 millimeter bakom huvudets botten. Använd ett par 5 Dumont-tångar för att trubbigt skära av synnerven och ta bort ögonen. Placera ena änden av de 5 tångarna under den högra parietalplattan.
Gör en avsiktlig saxåtgärd som rör sig mot rostraländen och ta bort den högra frontplattan. Rotera sedan fisken 90 grader medurs. Placera ena änden av de 5 tångarna under den vänstra parietalplattan och använd samma saxrörelse för att ta bort den vänstra parietal- och frontplåten och exponera hela hjärnans dorsala aspekt.
Använd de 5 tångarna för att trubbigt transect maxilla så att luktlökarna bevaras och inte skadas. Använd samma tång och ta bort rätt opercle, preopercle, interopercle och subopercle. Sedan trubbigt resect muskulaturen vid den kaudala änden av calvarium för att exponera ryggmärgen.
Använd tången, transectly ryggmärgen. Placera tången försiktigt under hjärnan och ta försiktigt bort hjärnan från golgon. Dissekera hela hjärnan eller intresseregionen med hjälp av instruktionerna i textmanuskriptet och placera hjärnan omedelbart på en liten vägbåt med fina tångar, var försiktig så att du inte hugger eller skrapar hjärnan.
Överför hjärnan till den tjärade torktumlarbåten och registrera hjärnans våta vikt. Orientera hjärnan för att lägga dem platt på vägbåten med den dorsala sidan vänd uppåt. Placera sedan hjärnan och torkvägsbåten i en hybridiseringsugn inställd på 60 grader Celsius i åtta timmar.
För att överföra hjärnan till en ny tjärad liten vägbåt när den är torr, nyp ihop de fina tångarna och, med början på hjärnans ventrala sida, skopa i en uppåtgående rörelse. Gör ett partiellt snitt på en våt svamp. Placera en fisk i taget i öppningen med ventralsidan uppåt och använd en 30-gauge nål för att injicera cirka 40 mikroliter av 10 millimolar EdU i fiskens kropp.
Sätt sedan tillbaka fisken till avloppstanken fylld med systemvatten. Samla hjärnorna som nämnts tidigare och placera dem som en grupp i en 9-milliliter glasflaska som innehåller 2 milliliter av nio delar 100% etanol till en del 37%formaldehyd. Fixera hjärnorna vid 4 grader Celsius på en rockerplattform.
Använd en kryostatchuck för att bädda in hjärnan i TFM i önskad orientering på torris. Vaskulär skada konstaterades vara en av de enklaste och mest framstående patologier att identifiera framgångsrika skada via denna modell. Förmågan att identifiera indikatorn ändrades med den fiskstam som används under skada.
Identifiering av vaskulär skada i vilda typ AB var svårt att skilja mellan antingen mild eller måttlig TBI och oskadad kontroll fisk på grund av att pigmentering. Efter skada visade den milda TBI fisken minimala ytan skrubbsår, medan den måttliga TBI fisken uppvisade begränsad cerebral blödning. Skadans omfattning var uppenbar i svår TBI fisk.
Däremot kan vaskulär skada lätt identifieras vid användning av albino eller Casper fisk. Svullnad i storhjärnan på grund av skada bedömdes med hjälp av ödem. Däremot hade både måttlig TBI och svår TBI betydande ödem, 1 dpi och 3 dpi, men vätskeinnehåll i både måttlig TBI och svår TBI återvände till nivåer som liknar oskadade kontroller med 5 dpi.
Denna trubbiga kraft skada resulterade i en robust cell spridning svar spänner över neuroaxis. Ökad EdU märkning observerades i ventrikulärt och subventricular zoner av forebrain jämfört med oskadade kontroller. De skadade hjärnorna visade ökad EdU märkning i periventricular gråzonen, de optiska tectal lober och aspekter av främre hypotalamus jämfört med den oskadade fisk hjärnan.
Efter allvarliga TBI uppvisade neurogena regioner i bakhjärnan ökad cellproliferation jämfört med den oskadade hjärnan. För korrekt induktion av skadan, se till att fisken är säkrad och stabil i formen, och att slangen är rak för att undvika påverkan utanför mitten eller ändra viktfallsbanan. Denna procedur ger en snabb och kostnadseffektiv trubbigt våld skada induktionsmetod tillämpas på en regenerativ modell som skulle vara särskilt tillämplig för upprepade huvudet trauma eller skada-inducerad regenerativa studier.
Vi modifierade Marmarou vikt droppe modell för vuxna zebrafisk att undersöka en bredd av patologier efter trubbigt våld traumatiska hjärnan skada (TBI) och mekanismerna bakom efterföljande neuronal regenerering. Denna trubbiga TBI-modell är skalbar, inducerar en mild, måttlig eller svår TBI och rekapitulerar skada heterogenitet som observerats i mänskliga TBI.
Read Article
Cite this Article
Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e62709, doi:10.3791/62709 (2021).
Copy