Biology
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बाकुलोवायरस-कीट सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) 2 वेक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए प्रक्रिया विकास
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Summary January 13th, 2022
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इस प्रोटोकॉल में, AAV2 वेक्टर को सह-संस्कृति स्पोडोप्टेरा मितव्ययीperda (Sf9) कीट कोशिकाओं द्वारा बाकुलोवायरस (बीवी)-AAV2-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या चिकित्सीय जीन और BV-AAV2-rep-टोपी संक्रमित Sf9 कोशिकाओं के साथ निलंबन संस्कृति में उत्पादित Sf9 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जाता है । एएवी कणों को डिटर्जेंट का उपयोग करके कोशिकाओं से छोड़ा जाता है, स्पष्ट किया जाता है, आत्मीयता कॉलम क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जाता है, और स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन द्वारा केंद्रित किया जाता है।
Transcript
यह प्रोटोकॉल उन जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा जो बाकुलोवायरस-कीट कोशिका संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके एएवी उत्पादन और शुद्धि के तरीकों को विकसित करना चाहते हैं। बाकुलोवायरस-कीट सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके एएवी उत्पादन एक लागत प्रभावी तरीका है जो बड़े पैमाने पर आसान है और वर्तमान अच्छे विनिर्माण अभ्यास के साथ संगत है। प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों एलन Heizer, मेरी प्रयोगशाला के एक अनुसंधान सहायक द्वारा प्रदर्शन किया जाएगा ।
Sf9 कोशिकाओं की एक शीशी को विगलन से शुरू करें, और तुरंत उन्हें कीट कोशिका संस्कृति माध्यम के 15 मिलीलीटर में बीज दें। हवा के आदान-प्रदान के लिए शिथिल-संलग्न टोपी के साथ राउंड-बॉटम फ्लास्क में 125 आरपीएम और 28 डिग्री सेल्सियस में एक कक्षीय शेखर इनक्यूबेटर में Sf9 कोशिकाओं को बढ़ाएं। टिप्स सेल उत्पादन के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माध्यम के 200 मिलीलीटर युक्त एक लीटर फ्लास्क में कोशिकाओं का प्रचार करें।
दो फ्लास्क में मिलीलीटर प्रति 6 पावर कोशिकाओं के लिए 2 गुना 10 पर Sf9 कोशिकाओं के 50 मिलीलीटर जोड़ें। बाकुलोवायरस-एएवी2-जीएफपी के 0.5 मिलीलीटर के साथ एसएफ9 कोशिकाओं के एक फ्लास्क को संक्रमित करें, और बाकुलोवायरस-एएवी 2-प्रतिनिधि-कैप के 0.5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं के अन्य फ्लास्क को संक्रमित करें। तीन दिन बाद, बाकुलोवायरस संक्रमित Sf9 कोशिकाओं, भी TIPS कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है की एक छोटी से aliquot फसल ।
दाग 2 बार 10 असंक्रमित और बाकुलोवायरस-संक्रमित Sf9 कोशिकाओं दोनों की 5 वीं शक्ति के साथ माउस एंटी-बाकुलोवायरस gp64 एंटीबॉडी के ०.५ माइक्रोग्राम के साथ अंधेरे में परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध के १०० माइक्रोलीटर में फ्लोरोसेंट डाई युक्त । एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, 0.5 गोजातीय सीरम एल्बुमिन युक्त पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर में दाग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर कोशिकाओं पर बाकुलोवायरस gp64 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
जब कोशिकाएं 80 से 90% व्यवहार्य होती हैं, व्यास में वृद्धि के साथ, कोशिकाओं और क्रायोप्रिजर्विज को कीट संस्कृति माध्यम के एक मिलीलीटर में 7 वीं शक्ति कोशिकाओं को 1 गुना 10 फसल, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 10% डिमेथिल सल्फॉक्साइड के साथ नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर धीमी ठंड वाले कंटेनर में लगाया जाता है। अगले दिन, टिप्स कोशिकाओं वाली ट्यूब को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन फ्रीजर में स्थानांतरित करें। संस्कृति और 2 गुना 10 पर भोली Sf9 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर मिलीलीटर प्रति 6 बिजली सेल के लिए कई दो लीटर एक शेखर इनक्यूबेटर में कीट सेल संस्कृति माध्यम के ४०० मिलीलीटर युक्त है कि adeno से जुड़े वायरस या AAV उत्पादन के लिए आवश्यक है ।
तीन से चार दिनों के बाद सेल डेंसिटी को 5 से 6 गुना तक बढ़ाकर 10 से छठी पावर सेल्स प्रति मिलीलीटर कर दिया जाता है । एक कक्षीय शेखर इनक्यूबेटर में फ्लास्क में एएवी उत्पादन के लिए, एक पिपेट या एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग 2 गुना 10 पर Sf9 संस्कृति के 400 मिलीलीटर बीज के लिए एक दो लीटर फ्लास्क में 6 वीं शक्ति कोशिकाओं के लिए, aseptically । 125 आरपीएम और 28 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय शेखर की स्थापना की।
प्रत्येक बाकुलोवायरस-एएवी-जीएफपी और बाकुलोवायरस-एएवी-प्रतिनिधि-कैप टिप्स कोशिकाओं की एक शीशी गल लें। कीट संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पतला करें, और ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की व्यवहार्यता गिनती करें। दोनों टिप्स कोशिकाओं को एक शेखर फ्लास्क या जैव रिएक्टर में सुसंस्कृत भोले Sf9 कोशिकाओं के सापेक्ष 1 से 10, 000 के अनुपात में टीका लगाओ ।
दूसरे दिन, Sf9 संस्कृति के एक मिलीलीटर को काटें, और सेल काउंट, व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए ट्राइपैन ब्लू डाई के साथ दाग दें। तीन दिन, दो दिन किए गए चरणों को दोहराएं, और एसएफ 9 कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद बाकुलोवायरस संक्रमण की स्थिति की जांच करें। पांच दिन, दूसरे दिन किए गए चरणों को दोहराएं, और फिर संस्कृति माध्यम और कोशिकाओं को फसल करें जब Sf9 व्यवहार्यता लगभग 50% तक कम हो गई है, जो कताई के बाद सुपरनैंट और सेल पेलेट को इकट्ठा करती है, और उन्हें नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करती है।
एक बार एएवी-प्रोड्यूसर सेल पेलेट गल जाने के बाद इसमें सेल लाइसिस बफर डालें और तेजी से मिलाएं । एएवी कणों को छोड़ने के लिए परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए फिर से निलंबित गोली को इनक्यूबेट करें। सेंट्रलाइज होने के बाद सेल को नए कंटेनर में ट्रांसफर कर लें।
विगलन के बाद सेल लिएट और सेल कल्चर सुपरनेट मिलाएं। डीएनए और आरएनए को पचाने के लिए कोशिका में प्रति मिलीलीटर नाभिक और 10-मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड 20 यूनिट जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर दो से चार घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एक पंप का उपयोग कर 0.8 माइक्रोमीटर और 0.2 माइक्रोमीटर पॉलीएथर्सल्फोन ड्यूल-फिल्ट्रेशन सिस्टम के माध्यम से lysate फ़िल्टर करें।
स्पष्ट सेल को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या एएवी को तुरंत शुद्ध करें। क्रोमेटोग्राफी मशीन पर एक 10 मिलीलीटर एवीबी सेफेरोज कॉलम माउंट करें, और पाइपलाइन को एएवी नमूने में डालें, बफर धोएं, और एल्यूशन बफर। कॉलम पास-थ्रॉलो सॉल्यूशन, वॉश बफर, और एएवी कणों वाले एल्यूशन बफर के अंशों को इकट्ठा करने के लिए क्रोमेटोग्राफी मशीन के अंश कलेक्टर स्लॉट में ट्यूब डालें।
पांच मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर पीबीएस के पांच कॉलम वॉल्यूम के साथ एवीबी सेफ्रॉज कॉलम को बराबर करें। एक नमूना पंप से लैस क्रोमेटोग्राफी मशीन का उपयोग कर एवीबी सेफरोज एफ़िनिटी कॉलम पर एएवी कणों युक्त फ़िल्टर सेल लिसेट लोड करें। प्रति मिनट तीन मिलीलीटर की प्रवाह दर पर नमूना चलाएं।
280 नैनोमीटर पर पराबैंगनी अवशोषण वक्र बेसलाइन पर लौटता है और स्थिर हो जाता है जब तक प्रति मिनट तीन मिलीलीटर की प्रवाह दर पर स्तंभ के माध्यम से PBS चलाएं। एल्यूट एवीबी सेफ्रॉस कॉलम से एएवी कणों को ५०-मिलीमोलर सोडियम साइट्रेट बफर पीएच 3 के साथ तीन मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर । एएवी युक्त अम्लीय एल्यूशन बफर को बेअसर करने के लिए तुरंत 500-मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल पीएच 8.0 की पांचवीं मात्रा के साथ एएवी सुपरनेटेंट को पतला करें।
यह पीएच-मध्यस्थता गिरावट को रोकता है जो अम्लीय पीएच 3.0 एल्यूशन बफर के साथ हो सकता है। फिर पीबीएस के साथ एएवी सुपरनेट दस गुना पतला करें, ताकि एएवी कण फिजियोलॉजिकल बफर में हों। लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण से एएवी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक कॉलम रन-थ्रेड नमूनों, वॉश बफर और एलुटेड एएवी सुपरनेट के 100 माइक्रोलीटर का एक मिलीलीटर स्टोर करें।
एएवी को केंद्रित करने के लिए 100 किलोडलटन आणविक वजन कटऑफ के साथ पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली कारतूस से लैस स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन प्रणाली स्थापित करें। स्पर्शोनियम प्रवाह निस्पंदन मॉड्यूल को बराबर करने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस के 200 मिलीलीटर चलाएं। पंप के प्रवाह को नियंत्रित करके एएवी नमूना लोड करें जब तक कि नमूना वांछित मात्रा तक कम न हो जाए।
पीबीएस के 100 मिलीलीटर के साथ रिएट्रेट करें। एएवी नमूने को वांछित मात्रा में केंद्रित करने के बाद, एएवी नमूने को एकत्र करें, इसे 0.2 माइक्रोमीटर पॉलीएथर्सल्फोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, और इसे अलीकोट करें। फिर एएवी नमूना नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
अधिकांश एसएफ 9 कोशिकाएं तीन से चार दिनों में बाकुलोवायरस से संक्रमित हो गईं, संक्रमण के कई दौरों के कारण, बाकुलोवायरस ग्लाइकोप्रोटीन जीपी 64 अभिव्यक्ति का सबूत है। अधिकांश कोशिकाओं में व्यास में वृद्धि भी दिखाई देती है। कोशिकाओं व्यास, साइटोपैथिक प्रभाव में वृद्धि दिखाने के लिए, और कोशिकाओं के लगभग आधे पांच दिनों में संक्रमण के बाद मर जाते हैं, जो AAV उत्पादन के पूरा होने के संकेत हैं ।
प्रोटीन की एक चोटी एएवी अंश के अनुरूप एक अम्लीय बफर के साथ काम करते हुए देखा गया था । शुद्ध एएवी नमूने तीन अलग कैप्सिड प्रोटीन दिखाते हैं: वीपी1, वीपी2 और वीपी3, एसडीएस-पेज और सिल्वर स्टेनिंग के बाद। सबसे महत्वपूर्ण कदम क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले टिप्स कोशिकाओं की कटाई है, जब अधिकांश कोशिकाएं बाकुलोवायरस से संक्रमित हो जाती हैं, जिसमें न्यूनतम संख्या सेल मृत्यु होती है।
हमने सेरोटाइप 2 के एएवी वेक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण को यहां एक मॉडल बताया है । हालांकि, प्रोटोकॉल अन्य एएवी सेरोटाइप के लिए भी लागू किया जा सकता है।
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