Isolering och urval av entomopathogena svampar från jordprover och utvärdering av svampvinulens mot insektsskadedjur

Metoden för entomopathogenic svamp isolering är viktigt för att utveckla mikrobiella kontrollmedel. Detta protokoll kan användas för att isolera och välja hög virulensentomopathogena svampisolat från jordproverna. Denna teknik innehåller tre spetsar av patogenicitet screening och kombinerar thermotolerance och conidia produktionsanalys för att göra den effektiva conidia nummer ranking.

Metoden kan hjälpa till att välja hög virulens och lovande entomopathogenic nya svamp isolat för kommersialisering. Detta protokoll fokuserar på biologisk bekämpning, det kan också användas för att upptäcka entomopathogenic svamp isolat för att studera interaktionen mellan skadedjur och entomopathogena svampar. Yao-Chia Liu och Nian-Tong Ni, masterstudent från mitt laboratorium, demonstrerar proceduren.

Börja med insamlingen av jordprovet genom att ta bort en centimeter av ytjorden och sedan samla jorden inom fem till 10 centimeters djup från varje provtagningsplats med en spade. Efter att ha registrerat detaljerna för varje provtagningsplats, samla in och underhåll 100 gram jordprov i en plastpåse vid rumstemperatur för att utföra svampisoleringsprotokollet inom tre timmar. För att isolera de potentiella entomopathogena svamparna, eller EPF, tillsätt 100 gram av jordprovet i en plastkopp och placera fem Tenebrio molitormaskar på jordens yta vid rumstemperatur i mörkret i två veckor med observation och registrering av larvdödlighet och mykos dagligen.

Håll den döda larven i koppen tills två veckor för svampisolering. Efter två veckor överför de döda insekterna till en ren bänk och använd en steril tandpetare för att samla conidia. För att få den primära svampkulturen, streak den insamlade conidia på en kvarts styrka Sabouraud dextrose agar medium eller SDA i en 55-millimetersplatta för att inkubera vid 25 grader Celsius i sju dagar.

På den åttonde dagen vilar du varje primärkultursvamp på en 55-millimeters kvartshållfast SDA-platta i en laminär flödeshuv innan du inkuberar kulturen vid 25 grader Celsius i sju dagar för att få enstaka kolonier av svampar. Vid den första patogenicitetsscreeningen placerar du fem Tenebrio molitor larver direkt på ytan av varje ren svampodlingsplatta vid 25 grader Celsius. Efter observation och registrering av mykos och dödlighet i 10 dagar, välj svamp isolat för ytterligare analys.

För att utföra det andra virulenstestet, skörda konidia av varje svampisolat genom att virvel i en minut och räkna antalet konidia med hjälp av en hemocytometer. När du är klar, justera conidia suspensionen till en koncentration av en gånger 10 till 1/7 conidia per milliliter i en 0,03% tensidlösning innan du sprider 10 mikroliter svampfjädring på en 55-millimeters kvartshållfast SDA-platta för att växa i sju dagar vid 25 grader Celsius i mörkret. På den åttonde dagen placerar du fem Tenebrio molitor larver direkt på ytan av varje ren svamp odlingsplatta och förseglar plattorna med Parafilm film för att inkubera medan du observerar mykos och dödlighet som beskrivs tidigare.

Efter att ha upprepat det andra virulenstestet i tre exemplar för varje svampisolat, välj isolat för att utföra tredje virulenstestet för målskadegöraren som Spodoptera litura. Samla cirka en kvadratmillimeter EPF från den sju dagar långa SDA-plattan med kvarts styrka för att extrahera svampgenomets DNA med hjälp av ett svampgenomiskt DNA-extraktionskit. Förstärk sedan den inre svampen transkriberad distanser eller ITS-region genom PCR av DNA-provet efter PCR-programmet som beskrivs i textmanuskriptet.

Efter sekvensering av den PCR-förstärkta produkten genom kommersiell sekvenseringstjänst, använd NCBI BLAST för att söka efter liknande svampar i NCBI-databasen och välja den relativa svamparten för fylogenetisk analys. Justera flera sekvenser och trimma den bevarade sekvensregionen manuellt med GeneDoc. Utför den fylogenetiska analysen baserat på minsta utveckling, grannkoppling och maximal sannolikhet.

För att studera svampens morfologi, fånga svampkulturkolonitillväxten i sju dagar med en kamera och registrera tillväxten, formen: fluffig eller fast och koloniernas färg. För att observera conidia i conidiophores, skrapa conidia från den rena odlade svampkolonin med en inokuleringsslinga och överför sporerna till en glasrutschbana som innehåller 0,1%Tween 80-lösning. Använd en skalpell för att skära ett agarblock i svampkolonin och överför sedan agarblocket till en glasrutschbana och tillsätt 0,1%Tween 80-lösningen för att tvätta bort det mesta av överskottet av conidia på agar.

Täck sedan bilden med en täcklapp för ljus mikroskopisk observation av conidia. Mät och registrera bredden och längden på conidia och konidiforer för att jämföra skillnaden mellan olika svampisolat. Ordna en konidiell produktionsanalys genom att odla det valda svampisolatet på kvartshållfast SDA-medium vid cirka 25 grader Celsius i mörkret i 10 dagar.

Förbered sedan en milliliter konidial suspension av svampisolatet i 0,03% tensidlösning följt av att justera koncentrationen till en gång 10 till 1/7 conidia per milliliter enligt beskrivningen tidigare. Efter att ha lagt till tre droppar av 10 mikroliter konidiell suspension på en kvarts styrka SDA-platta, inkubera kulturen vid 25 grader Celsius i mörkret i sju, 10 och 14 dagar för att räkna svampens sporulering. Vid varje tidpunkt lossar du ett fem millimeters agarblock från mitten av kolonin med en korkborrare och överför blocket till ett 1,5-milliliter mikrocentrifugerör som innehåller en milliliter 0,03% tensidlösning.

Efter att ha virvlar röret vid 3 000 rotationer per minut vid rumstemperatur i 15 minuter, använd en hemocytometer för att räkna antalet conidia. För termotoleransanalysen, odla det valda svampisolatet och förbered en gång 10 till 1/7 conidia per milliliter suspension som illustreras tidigare. Efter virvel, värm den konidala suspensionen i ett torrt bad vid 45 grader Celsius för olika tidsintervaller.

Efter värmeexponering, tillsätt tre droppar av fem mikroliter konidiell suspension på en 55-millimeters kvartshållfast SDA-platta vid varje tidpunkt och inkubera sedan plattorna vid cirka 25 grader Celsius i 18 timmar. För att bestämma grobarheten, räkna antalet grodda conidiasporer med fem slumpmässigt utvalda fält under ljusmikroskopet vid 200 gånger förstoring. Beräkna det totala effektiva conidianumret eller ECN med hjälp av formeln och beräkna sedan principkomponentanalys eller PCA av svampstammar som beskrivs i manuskriptet.

Välj de bäst presterande svampstammarna baserat på ECN eller PCA för att utföra virulenstestet av målskadedjur. I det andra virulenstestet bedömdes virulensen hos de 26 svampisolaten mot Tenebrio molitor mjölmaskar. 12 svamp isolat med hög patogenicitet valdes för virulens test mot Spodoptera litura.

För att bättre förstå svamp taxonomiska positioner, 26 isolat från den första patogenicity screening utsattes för molekylär analys baserat på ITS regionen. Genom rengöringsmetoden för svampmorfologiska observationer kunde strukturerna hos konidifoster ses tydligt med 0,1%Tween 80-lösning. Conidias färg, form och arrangemang studerades genom mikroskopiska observationer av conidia kolonin.

ECN kombinerar konfididiaproduktions- och termotoleransdata för varje EPF. Den höga livskraften hos en svampstam observerades när ECN-värdet var högt. Dessutom avslöjades en stor samordning mellan det europeiska eller de europeiska konkurrenskontrollåtgärderna, vilket tyder på att det europeiska konkurrens konkurrens och information skulle kunna användas för att utvärdera hierarkin för lönsamhetsrelaterade parametrar.

Patogenicitet screening extrahera svamp DNA och odling svamp isolat är viktigt i förfarandet. Genom att använda ECN-beräkningsformeln kan de idealiska interna patogena svamparna väljas. Kombination av olika insektsarter, såsom större vaxmoth och mjölmask tillsammans för att bete de entomopathogena svamparna från jordproverna kan öka mångfalden av entomopathogena svampar.

Jordens mikroorganismmångfald är ett mycket intressant ämne under driften av detta protokoll. Det skulle också kunna undersökas ytterligare i framtiden via detta protokoll.