Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Regulatoren van melanocytenfuncties regelen zichtbare verschillen in de pigmentatie-uitkomst. Het ontcijferen van de moleculaire functie van het kandidaat-pigmentatiegen vormt een uitdaging. Hierin demonstreren we het gebruik van een zebravismodelsysteem om kandidaten te identificeren en in te delen in regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.
Transcript
Dit protocol is een samensmelting van verschillende technieken die de onderzoekers in staat zouden stellen om de rol van kandidaat-gen in de melanocytenbiologie af te bakenen. Het is een holistische benadering om tot een logische gevolgtrekking te komen. Door verschillende methoden te combineren, kunnen verstorende factoren worden vermeden en kan het onderzoekers helpen een substantieel resultaat te behalen.
Om de analyse te beginnen, immobiliseert u de 48 HPF-embryo's met 0,016% tricaïne. Monteer de embryo's met behulp van enkele milliliters 1,5 tot 2% methylcellulose in een petrischaaltje. Pluk de embryo's met een Pasteur-pipet en plaats ze in methylcellulose om beweging tijdens de beeldvorming te beperken.
Voor optimale laterale of dorsale beeldvorming past u hun positie aan met een vergroting van meer dan 5x. Leg de petrischaal onder de microscoop. Stel met behulp van een manipulator de vis zo in dat alle vijf de embryonale strepen van melanocyten tegelijkertijd zichtbaar zijn.
Leg met behulp van de acquisitiesoftware de beelden vast. Als de vis ontwaakt, plaats hem dan in tricaïnewater totdat hij stabiliseert. Open met behulp van de open tool in ImageJ-software de afbeelding die moet worden gekwantificeerd.
Selecteer het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen. Selecteer de optie metingen instellen, klik op de gemiddelde grijswaarde en vervolgens op het gebied. Om de gemiddelde grijswaarde voor het geselecteerde gebied te berekenen, klikt u op M of gaat u naar analyseren en selecteert u meten.
Breng op basis van het stadium van interesse de embryo's over naar een petrischaal met 0,6 milligram per milliliter Pronase. Breng met behulp van een Pasteur-pipet de gedechorioneerde embryo's na vijf tot 10 minuten over in een petrischaal met gewoon embryowater. Verzamel met een glazen Pasteurpipet ongeveer 100 embryo's en breng ze over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter.
Gooi het medium weg en voeg 200 microliter ijskoude deyolking Ringers-oplossing toe. Plaats de buis op ijs en meng de inhoud ongeveer 20 keer met een pipet om het juk op te lossen. Centrifugeer de buisjes twee keer op 100 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.
Breng de ontdooierde embryo's over met behulp van een pipet van één milliliter in een petrischaaltje met 10 milliliter trypsine-oplossing. Meng de oplossing een of twee keer met behulp van een pipet van één milliliter om de aggregatie te verminderen. Passeer de trypsinized suspensie door een 70 micrometer zeef geplaatst op een 50 milliliter conische buis om een enkele cel suspensie te verzamelen.
Was de petrischaaltjes met de trypsinized suspensie om de aangehechte cellen van het oppervlak te verwijderen. Voor het tellen van de fluorescerend gelabelde cellen met behulp van een flowcytometer, tekent u na het maken van een nieuwe experimentmap een voorwaartse versus zijverstrooiingsplot. Maak een histogram voor de intensiteit van fluoresceïne-isothiocyanaat.
Laad eerst de wildtypecellen om de voorwaartse en zijwaartse spreidingspoorten en de FITC-drempel in te stellen. Laad daarna de cellen geïsoleerd uit transgene FTYRP GFP-lijnembryo's om de melanocyten te tellen. Monteer de embryo's in 1,5 tot 2% methylcellulose in een petrischaaltje.
Plaats het onder de microscoop en stel het in de gewenste richting in met behulp van een pipetpunt. Met behulp van de acquisitiesoftware kunt u de afbeeldingen verkrijgen. Voor embryo's van minder dan 24 HPF, met behulp van 10X vergroting, leg het hele beeld vast, terwijl voor embryo's van meer dan 24 HPF, meerdere scanvelden worden verkregen en vervolgens worden samengesteld.
Na het uitvoeren van de test onthulde de Brightfield-beeldvorming na 48 uur de aanwezigheid van alle vijf gepigmenteerde melanofoorstrepen. In het 48 HPF-stadium werd het aantal laterale melanoforen berekend en bleek dat de histonvariant h2afv-morfanten een verminderd aantal melanoforen vertoonden in vergelijking met de controlegroep. De gemiddelde grijswaarde werd gemeten voor CA14- en h2afv-morfanten, waaruit bleek dat de waarden hoger waren voor de varianten dan de controlemorfanten.
Door gebruik te maken van een op natriumhydroxide gebaseerde spectrofotometrische absorptiemethode werd het melaninegehalte gekwantificeerd waarbij de CA14-morfanten minder inhoud vertoonden dan de controlemorfanten. Fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd om morfolino-gebaseerde verandering voor verschillende stadia van de ontwikkeling van zebravismelanofoor te evalueren. Het aantal melanoforen in CA14- en h2afv-morfanten werd geanalyseerd met behulp van FACS.
Er werd waargenomen dat het aantal melanoforen in CA14 onveranderd bleef, terwijl ze significant verminderd waren in h2afv in vergelijking met de controlemorfant. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit per gebied werd ook berekend, wat aantoont dat de h2afv-morfanten een aanzienlijke afname van de waarde ten opzichte van controlemorfanten vertonen. Terwijl je de vis aanpast voordat je de foto maakt, moet je ervoor zorgen dat je alle vijf melanofoorstrepen kunt visualiseren.
Je moet de vis een beetje kantelen om onderscheid te maken tussen de twee zijstrepen. Nadat we de rol van een kandidaat-gen in de ontwikkeling van melanocyten hebben vastgesteld, kunnen we het gen op een weefselspecifieke manier elimineren met behulp van CRISPR-technologie. Dat zal een meer gerichte aanpak zijn.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
