Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fotodegraderbara Hydrogelgränssnitt för bakteriescreening, urval och isolering
Chapters
Summary November 4th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Användningen av fotodegraderbara hydrogeler för att isolera bakterieceller genom att använda ett högupplöst ljus pattering verktyg rapporteras. Viktiga experimentella procedurer, resultat och fördelar med processen ses över. Metoden möjliggör snabb och billig isolering av riktade bakterier som visar sällsynta eller unika funktioner från heterogena samhällen eller populationer.
Transcript
Detta protokoll är utformat för att snabbt isolera celler från screeninggränssnitt för genomisk karakterisering och denna förmåga är betydande eftersom den kan kombinera makroskopiskt observerbara cellfunktioner med genomisk information. De riktade bakteriecellerna från screeninggränssnitten kan isoleras med hög rumslig position på ett operativt enkelt sätt med hjälp av denna teknik. Hydrogelerna kan implementeras i andra screeninggränssnitt.
Hydrogelmaterialet kan enkelt införlivas i mikrofluidiska kanaler för hämtning av celler på begäran från mikrofluidiska enheter. Börja med att inokurera korslänkningsbufferten med önskad celltäthet. Förbered hydrogelprekursorlösningen i ett 0,5 milliliter mikrocentrifugerör genom att tillsätta 12,5 mikroliter av korslänkningsbufferten och 5,6 mikroliter PEG ONB-diacrylatlösning.
Och slutligen tillsätt 6,9 mikroliter underarm PEG tioollösning till blandningen. För cellinkapsling i hydrogelprekursorlösningen, placera de tioolerade basöverdragen på en ren Petri-skål och placera två distanser på de två motsatta sidorna av täckslipet. Fixera distanserna på basöverdraget genom att tejpa distanserna på Petri-skålen.
Efter att ha lagt till önskad volym av prekursorlösningen på en icke-reaktiv perfluoralkylerad glasrutschbana, placera bilden på bottenöverdraget och låt hydrogelbildningen slutföras vid rumstemperatur i 25 minuter. När geleringen är klar, ta försiktigt bort den perfluoralkylerade glasrutschbanan. Placera substratet i 60 x 15 millimeter Petriskålen som innehåller ATGN-medier kompletterat med antibiotika.
Frö 700 mikroliter av bakteriella cell suspensioner med OD 600 av 0,1 över microwell array substrat och gör hydrogelprekursorlösningen som visats tidigare med hjälp av 12,5 mikroliter fosfatbuffrad koksaltlösning ATGN av pH åtta. Pipetter 12,5 mikroliter av prekursorlösningen på en icke-reaktiv perfluoralkylerad glasrutschbana och placera två 38 mikrometer stål distanser på två motsatta sidor av mikrobrunnsmatrissubstrat innoculated med celler. Vänd sedan in den perfluoralkylerade glasrutschbanan med prekursorlösningsdroppen och placera en droppe i mitten av mikrobrunnssubstratet.
När hydrogelen bildas efter en inkubation på 25 minuter vid rumstemperatur, ta försiktigt bort glasglasglaset från mikrobrunnssubstratet och placera substratet i en Petri-skål som innehåller ATGN-medier kompletterade med antibiotika. Placera provet i en PDMS-hållare och lägg till det definierade mediet ovanpå provet för att förhindra provbrist och tillhandahålla en bärarlösning för utsläppta celler. Efter att ha fört kalibreringsspegeln på plats, justera mikroskopets fokus för att få en skarp bild av kolonierna i hydrogel- eller mikrobrunnmatrisen och inspektera för att identifiera kolonier eller brunnar av intresse.
Här utformar du ljusmönstren medan kameravyn visar kolonierna inuti provet för att testa olika mönster för cellutsugning och spara det definierade mönstret. Välj sedan avsnittet sessionskontroll, lägg till den sparade sekvensen under fliken med det mönstrade belysningsverktygets produktnamn. Välj alternativet för att stimulera mönstret för att visa och justera önskad exponeringsplats.
Justera sedan ljusintensiteten till 60% och exponeringstiden till 40 sekunder under LED-kontrollfliken och starta exponeringsprocessen. Övervaka hydrogelnedbrytningen i realtid och Brightfield-läge för att säkerställa cellutgivningen. För att samla in den frigjorda cellen, byt mikroskopfiltret från Brightfield till TRITC för att visualisera det exponerade området av provet med blotta ögat.
När det exponerade området är placerat, placera änden av slangen på den bestrålade platsen och byt sedan mikroskopfiltret tillbaka till Brightfield för att övervaka cellhämtning i realtid. Använd sprutan som är fäst vid den andra änden av slangen för att försiktigt dra ut 200 mikroliter lösning som innehåller de utgivna cellerna och överföra lösningen till ett 1,5 millimeters centrifugrör för DNA-analys eller plätering. Olika UV-ljus mikromönster användes för cell extraktion från bulk hydrogeler, vilket påverkade morfologin i de utsläppta cellerna.
UV-exponeringen i ett ringmönster resulterade i frisättningen av hela kolonin inkapslad i en skyddande PEG hydrogel. Genom att utsätta hela eller delar av kolonin för UV-ljus kan celler däremot extraheras antingen som aggregerade cellkluster eller som fria enskilda celler. Cellsåddtätheten och tjockleken på hydrogelen är viktiga för cellkapsling.
De tunnare hydrogelerna resulterade i mikrokolonier med minimal koloniöverlappning, medan hydrogelerna med ökad tjocklek resulterade i överlappande kolonier, vilket kan resultera i utvinning av flera kolonier. Överlappande kolonier kan orsaka korskontaminering under extraktion på grund av ljusmönstrets tvådimensionella karaktär. När en toppkoloni var måltavla, extraherades den underliggande kolonin också med den.
Effekten av olika UV-ljus mikro mönster på cellens livskraft bedömdes också. När mikrokolonier utsattes för kontrollerade doser av UV-ljus i antingen ett cirkulärt eller tvärmönster påverkades inte cellåtervinning och DNA-renhet. Cellerna hämtades framgångsrikt från microwell matriser med denna metod, vilket var uppenbart från de representativa confocal mikroskopi bilder, där vid bestrålning i cirkulära och ring mönster, cellerna togs bort i respektive mönster.
Efter extraktion från microwell matriser bedömdes cellens livskraft och DNA mängd. Exponeringsmönstren påverkade varken det livskraftiga cellantalet eller DNA-kvaliteten, vilket indikerar att livskraftiga bakterieceller selektivt kunde hämtas från mikrobrunnar med minimal skada, och deras DNA kunde isoleras vid hög renhet för nedströms genomisk analys. Kontrollera alltid att hydrogelen har bildats innan du tar bort det perfluoralkylerade täcket.
Precision och försiktighet krävs för att placera distanserna för hydrogeldeposition och använda slangarna för extraktion av celler.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
