Användningen av fotodegraderbara hydrogeler för att isolera bakterieceller genom att använda ett högupplöst ljus pattering verktyg rapporteras. Viktiga experimentella procedurer, resultat och fördelar med processen ses över. Metoden möjliggör snabb och billig isolering av riktade bakterier som visar sällsynta eller unika funktioner från heterogena samhällen eller populationer.
Biologer har länge försökt förstå förhållandet mellan fenotyp och genotyp. För att bättre förstå denna koppling är det viktigt att utveckla praktisk teknik som kopplar mikroskopisk cellscreening med cellisolering vid hög renhet för nedströms genetisk analys. Här beskrivs användningen av fotodegraderbara poly (etylenglykol) hydrogeler för screening och isolering av bakterier med unika tillväxtfenotyper från heterogena cellpopulationer. Metoden bygger på att kapsla in eller fånga celler med hydrogelen, följt av kultur, mikroskopisk screening, sedan användning av ett högupplöst ljusmönsterverktyg för spatiotemporal kontroll av hydrogelnedbrytning och frisättning av valda celler i en lösning för hämtning. Genom att använda olika ljusmönster kan man kontrollera den extraherade cellens morfologi, och mönster som ringar eller kors kan användas för att hämta celler med minimal direkt UV-ljusexponering för att minska DNA-skador på isolaten. Dessutom ger ljusmönsoneringsverktyget en justerbar ljusdos för att uppnå olika nedbrytnings- och cellfrisättningshastigheter. Det möjliggör nedbrytning vid hög upplösning, vilket möjliggör cellhämtning med rumslig precision i mikronskala. Här demonstreras användningen av detta material för att screena och hämta bakterier från både bulkhydrogeler och mikrofabricerade lab-on-a-chip-enheter. Metoden är billig, enkel och kan användas för vanliga och framväxande tillämpningar inom mikrobiologi, inklusive isolering av bakteriestammar med sällsynta tillväxtprofiler från mutanta bibliotek och isolering av bakteriella konsortier med framväxande fenotyper för genomiska karakteriseringar.
Isolering av celler med unika beteenden från en komplex och heterogen miljö är grundläggande för att få genetisk information i biologi1. Inom mikrobiologi blir valet och isoleringen av sällsynta eller unika mikrober efter observation viktigt i många tillämpningar som kräver en koppling mellan genomisk information och observerbar fenotypisk information. Dessa applikationer inkluderar att välja fenotypiskt sällsynta stammar från mutanta bibliotek2, välja keystone mikroorganismer från komplexa mikrobiella samhällen3,4, och välja fenotypiskt sällsynta men viktiga bakterier från isogenic populationer. Isolering av livskraftiga men icke-okrturerbara celler (VBNC) från en bakteriepopulation är ett viktigt exempel på den senare, där celler med VBNC-fenotypen ofta är dolda i bakteriepopulationer vid 1:102 till 1:105 förhållanden5,6. På grund av de utbredda svårigheterna i bakterieisolering är mycket fortfarande okänt om många fenotypiskt sällsynta mikroorganismer. Dessa begränsningar betonar behovet av cellisoleringstekniker för att först identifiera målcellen eller cellerna från en blandning och sedan hämta och isolera dem för nedströms molekylär analys7.
Några av de vanligaste metoderna för cellisolering inkluderar flödescytometri och fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS)8,immunomagnetisk separation9,10och mikrofluidik11. Även om dessa isoleringsmetoder har högt värde, har de också nackdelar som begränsar deras användning. FACS kan till exempel tillhandahålla rutinmässig mikrobiell isolering på encellsnivå för uppföljande genomisk analys3 men begränsas ofta av dess tillgänglighet och kostnad, liksom nedströmsföroreningsproblem11. Mikrofluidbaserade metoder såsom mikrofluidisk flödescytometri har fått mycket uppmärksamhet, vilket jämfört med konventionell flödescytometri möjliggör en betydande minskning av den provvolym som krävs12. Separation och hämtning av en enskild eller liten samlingar av celler från mikrofluidiska enheter är dock ofta ett utmanande problem som vanligtvis kräver en mer komplex installation och enhetsdesign13. Många mikrofluidiska metoder karakteriserar genetiskt celler innan de matas in och observeras i en enhet14, vilket begränsar antalet unika arter som observeras när de utför en funktionell skärm. Med tanke på dessa begränsningar krävs ytterligare innovation av både metoder och material som är praktiska för cellscreening och isolering för utbredd användning i många laboratorier.
Detta dokument presenterar en ny, materialbaserad metod för bakteriescreening och isolering. Metoden använder fotodegraderbara hydrogeler för cellinkapsling, kultur, mikroskopisk observation och frisättning på begäran och återvinning av riktade bakterier med unika fenotyper. Hydrogeler är konstruerade för att innehålla 10 nm maskstorlek, där varje tvärlänk innehåller o-nitrobenzyl grupper15. Materialet kapslar in eller fångar celler för observation samtidigt som det möjliggör diffusion av näringsämnen och avfallsprodukter till och från celler för odling. Genom att utsätta materialet för en mönstrad 365 nm UV-ljuskälla genom ett upprätt mikroskop möjliggör lokal nedbrytning av hydrogelen genom fotokelavage av o-nitrobenzylgrupper16, 17. Nedbrytning utlöser selektiv frisättning av celler för återvinning för nedströms analys, inklusive genomisk och, potentiellt, proteomisk och transkriptomisk analys. Den experimentella installationen och protokollet är relativt enkla, billiga och translationella till mikrobiologiska laboratorier. Det kräver endast cellinkapsling genom hydrogelbildning, observation av fångade celler med ett upprätt ljusfält och fluorescensmikroskop och belysning av celler av intresse med en mönstrad UV-ljuskälla för hämtning.
En viktig fördel med denna materialbaserade metod för screening är dess anpassningsförmåga till olika screeningformat. I sitt mest grundläggande format kan materialet användas för screening genom att kapsla in en heterogen cellsamling i bulkhydrogeler. Celler observeras sedan för önskad fenotyp, och enskilda celler av intresse tas bort för genomisk karakterisering. I mer genomarbetade format kan materialet också integreras i lab-on-a-chip-enheter för att ge exakt cellutlösning och hämtning från önskade områden av enheten. Båda formaten beskrivs här, och båda har möjliggjort nyligen ny mikrobiell screening och urvalsapplikationer17,18,19. Metoden demonstreras här med modell gramnegativa organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) och en modell Grampositiv organism (Bacillus subtilis) och har lätt utvidgats till en mängd andra bakterier.
Detta manuskript visar användningen av fotodegraderbara hydrogeler för bakteriescreening och isolering. Materialet och tillvägagångssättet möjliggör hög genomströmningskultur, kontroll över tillväxtmedier och tillväxtförhållanden samt ren och exakt cellutvinning på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt. Extraktion kräver endast ett fluorescerande mikroskop i kombination med det mönstrade belysningsverktyget och kan göras på ett sekventiellt sätt för att isolera flera cellmål. Varje extraktion tar 5-10 min att utföra, och upp till 30 riktade kolonier har tagits bort från en enda hydrogel. En viktig fördel med tillvägagångssättet är dess anpassningsförmåga till en mängd olika analysformat, vilket visas här med screening från både bulkhydrogeler och mikrobrunnmatriser. Separationsprocessen i båda formaten har framgångsrikt använts för att isolera bakterier som visar unikt tillväxtbeteende för nedströms genotypning efter kultur och mikroskopisk observation, en kritisk förmåga att ansluta cellgenotyp till fenotyp. Hittills har genomiska karakteriseringar av bakterier som extraherats från dessa gränssnitt inkluderat 16S amplicon sekvensering för att identifiera multiartsamlingar av bakterier från miljömikrobiomer som genererar framväxande tillväxtbeteende18, och för helgenomsekvensering för att framgångsrikt identifiera genetiska mutationer som orsakar sällsynta tillväxtprofiler i celler som finns i mutantbibliotek19.
Att använda bulkhydrogeler för cellscreening och isolering är det enklaste och enklaste formatet. Bulk fotodegraderbara hydrogeler bildas snabbt (25 min) efter att ha blandat prekursorerna över genomskinliga glasöverdrag för att kapsla in celler i en 3D-cellskulturmatris som är avbildad med ett standard upprätt eller inverterat fluorescensmikroskop. Metoden har således potential att kunna translationseras till vanliga mikrobiologiska laboratorier som inte har mikrotillverkningsresurser eller expertis. En nackdel med detta format är att celler är slumpmässigt orienterade i hela den tredimensionella hydrogelen. Därför kan celler dyka upp ur fokalplanet när avbildning med högre förstoringsmål och extraktion kan vara svårt om cellkolonier är orienterade för nära varandra eller om det finns ett vertikalt överlägg av kolonier. Att deponera en tunn hydrogel (<13 μm) enligt beskrivningen är avgörande för att mildra denna nackdel. Exponering i trasiga korsljusmönster (figur 4B) är att föredra här, eftersom detta mönster resulterar i celler fria från hydrogelen som har minimal exponering för UV-ljus och lätt kan återvinnas genom plätering.
Däremot ger mikrobrunnsmatrisformatet ett mer välkontrollerat gränssnitt, eftersom bakterieceller är uppdelade i diskreta mikrobrunnar som fungerar som små kultur- eller samkulturplatser17,18,26. Mikrobrunnsdimension, tonhöjd och densitet tillverkas exakt med hjälp av vanliga fotolitografiska tekniker. Jämfört med bulkhydrogeler kan bakterier extraheras från mikrobrunnmatriser med högre grad av specificitet och lägre risk för korskontaminering, eftersom cellerna endast finns på fördefinierade platser, inte slumpmässigt spridda över hela hydrogelen. Koncentrationen och förhållandet mellan bakterieceller i såddlösningen kan också varieras för att kontrollera mängden och sammansättningen av mikrowellinokulat genom en såddprocess som har karakteriserats i tidigare rapporter26, vilket ger användaren flexibilitet i skärmens experimentella design. Den främsta nackdelen med screening med microwell array-formatet är den extra tid och expertis som krävs för mikrotillverkning. Tillverkning av mikrobrunnar beräknades kosta ~ $ 10 per matris, vilket inkluderar materialkostnader och renrumskostnader. Dessutom är mikrobrunnsystem traditionellt gjorda av kisel, vilket kan orsaka bildsvårigheter eftersom substraten är icke-transparenta. Dessutom kan en stor mängd ljusspridning från kiselytan begränsa avbildningen i mikrobrunnarna och kan minska mönsterupplösningen vid hydrogelexponering med UV-ljus från det mönstrade belysningsverktyget (se figur 8A,B). Liknande mikrobrunnar har tillverkats på genomskinliga kvartssubstrat för att ta itu med dessa typer av begränsningar27; Denna tillverkning är dock betydligt svårare. Exponering för ringmönster som belyser brunnens omkrets är att föredra här för att frigöra fria celler från brunnarna samtidigt som UV-exponeringen minimeras.
Det vanligaste problemet som uppstår i båda formaten är avlossning av hydrogelen från det underliggande substratet under odling på grund av hydrogelsvullnad. Om detta är ett problem för bulkhydrogeler, bör förekomsten, densiteten och enhetligheten hos tiolgrupper i kemikalieskiktet (MTPS) över ytan av basglastäcket verifieras med hjälp av en lämplig ytkarakteriseringsteknik (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Låg densitet av ytt tiol grupper på grund av ineffektiva ytan funktionalisering kan leda till en svag interaktion mellan substratet och hydrogelen. Om en låg nivå av ytt tiolation uppstår, bör stabiliteten hos MTPS-lösningen kontrolleras. Vid den första rengöringen av glasrutschbanan bör man vara försiktig med att säkerställa en ren yta före MTPS-behandlingen, och försiktighet bör iakttas för att säkerställa användning av vattenfri toluen under MTPS ytreaktion (protokoll avsnitt 4). När det gäller mikrobrunnmatriser är ytorna inte tiolerade, och hydrogeler fäster istället genom den partiella fyllningen av brunnarna med hydrogelen, som förankrar hydrogelen till kiselsubstratet17. Om hydrogelavlossning är ett problem i detta system kan fler mikrobrunnar eller andra mikroskalefunktioner etsas in i matrisen för att ytterligare förankra hydrogelen på substratet för att främja starkare fastsättning.
En begränsning av tekniken i båda formaten är hydrogelernas begränsade stabilitet i närvaro av bakterier. Det har noterats att vissa bakterier, såsom A. tumefaciens, kan bryta ner hydrogelen under loppet av 5-7 dagar17,19, vilket begränsar experimenttiden. Pågående undersökning av mekanismerna för bakteriell nedbrytning pågår. det är en hypotes att de estergrupper som finns från diacrylatemonomererna utsätts för bakteriemedierad hydrolys och/eller enzymatisk nedbrytning, som noterats i andra system17. Att utveckla mer stabila hydrogelkemier kommer att förlänga den tid som bakterier kan finnas kvar i hydrogelen och kommer att utöka skärmen till mikroorganismer med långsammare tillväxttakt. En andra begränsning är att cellåtervinning och extraktion sker i båda formaten i en öppen miljö, vilket resulterar i relativt höga extraktionsvolymer (30-100 μL), som kan vara mottagliga för yttre förorening. Därför måste man se till att det finns tillräckligt med celler från målkolonierna samtidigt som extraktionslösningens volym minimeras. För att erhålla tillräckligt med celler för plätering och återvinning eller för extraktion av DNA-material observerades att i bulkhydrogeler måste cellerna odlas tillräckligt länge för att nå kolonidiametrar på minst 10 μm. För att sänka den erforderliga volymen för celluttag observerades det att användningen av en mikroliterspruta och slangar(figur 2) var effektivare än pipettering. Slangen gjorde det möjligt att dra isolaten från utsläppspunkten mer exakt, vilket krävde mindre lösningsvolym och minskade risken för förorening.
Framtida arbete innebär att förstå effekten av hydrogelmekaniska egenskaper på celltillväxt, eftersom mekaniska egenskaper hos dessa hydrogeler styrs väl av valet av lämpliga PEG-baserade monomerprekursorer av olika molekylvikter28, och mekaniska interaktioner spelar sannolikt en viktig roll i bakteriebeteende29. Eftersom hydrogelmaterialen lätt kan införlivas i en mängd olika system och enheter, är vidareutveckling också inriktad på integrering av detta material i mikrofluidiska system. Detta skulle minska extraktionslösningen till femtoliter till picolitervolymer, jämfört med traditionella 30-100 μL-volymer som för närvarande krävs i open collection-format. Mindre lösningsvolymer skulle kraftigt minska potentiell förorening och flytta tillvägagångssättet mot encellsisolering och karakterisering.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av NSF CAREER Award #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |