Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fotodegradable Hydrogel-grænseflader til bakteriescreening, udvælgelse og isolation
Chapters
Summary November 4th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Brugen af fotodegradable hydrogels til at isolere bakterieceller ved at udnytte et lyspatteringsværktøj i høj opløsning rapporteres. Væsentlige eksperimentelle procedurer, resultater og fordele ved processen gennemgås. Metoden muliggør hurtig og billig isolering af målrettede bakterier, der viser sjældne eller unikke funktioner fra heterogene samfund eller befolkninger.
Transcript
Denne protokol er designet til hurtigt at isolere celler fra screening grænseflader til genomisk karakterisering og denne evne er betydelig, fordi det kan kombinere makroskopisk observerbare celle funktioner med genomisk information. De målrettede bakterieceller fra screeningsgrænsefladerne kan isoleres med høj rumlig position på en operationelt enkel måde ved hjælp af denne teknik. Hydrogelerne kan implementeres i andre screeningsgrænseflader.
Hydrogelmaterialet kan let indarbejdes i mikrofluidiske kanaler til on-demand hentning af celler fra mikrofluidiske enheder. Begynd med at pode krydsbindingsbufferen med den ønskede celletæthed. Hydrogelprækursoropløsningen forberedes i et 0,5 milliliter mikrocentrifugerør ved at tilsætte 12,5 mikroliter af krydsbindingsbufferen og 5,6 mikroliter peg ONB-diakrylatopløsning.
Og endelig tilsættes 6,9 mikroliter af underarm PEG thiolopløsning til blandingen. For celleindkapsling i hydrogel prækursor opløsning, placere thiolated base coverslips på en ren Petri parabol og placere to afstandsstykke på de to modsatte sider af coverlip. Fix afstandsstykket på bunddækslerne ved at tape afstandsstykket til Petriskålen.
Efter at have tilføjet den ønskede volumen af forløberopløsningen på en ikke-reaktiv perfluoralkyleret glasrutschebane, skal du placere diaset på bunddækslen og lade hydrogeldannelsen fuldføre ved stuetemperatur i 25 minutter. Når geleringen er færdig, skal du forsigtigt fjerne den perfluoralkylerede glasrutschebane. Placer substratet i 60 med 15 millimeter Petriskål indeholdende ATGN medier suppleret med antibiotika.
Frø 700 mikroliter af bakteriecelleophæng med OD 600 af 0,1 over mikrowell array substratet og gør hydrogel prækursor løsning som påvist tidligere ved hjælp af 12,5 mikroliter af fosfat buffered saltvand ATGN af pH otte. Pipette 12,5 mikroliter af prækursoropløsningen på en ikke-reaktiv perfluoralkyleret glasrutschebane og placere to 38 mikrometer stål spacers på to modsatte sider af mikrowell array substrat podet med celler. Vend derefter den perfluoralkylerede glasrutschebane med forløberopløsningsdråben og læg en dråbe midt i mikrowellsubstratet.
Når hydrogelen dannes efter en inkubation på 25 minutter ved stuetemperatur, skal du forsigtigt fjerne glasglittet fra mikrorumssubstratet og placere substratet i en petriskål, der indeholder ATGN-medier suppleret med antibiotikum. Placer prøven i en PDMS-holder, og tilføj det definerede medie oven på prøven for at forhindre prøvedehydrering og levere en bæreløsning til frigivne celler. Når kalibreringsspejlet er på plads, skal du justere mikroskopfokus for at få et skarpt billede af kolonierne i hydrogel- eller mikrowellsystemet og inspicere for at identificere kolonier eller brønde af interesse.
Her skal du designe lysmønstrene, mens kameravisningen viser kolonierne inde i prøven for at teste forskellige mønstre til celleudtrækning og gemme det definerede mønster. Vælg derefter afsnittet sessionskontrol, tilføj den gemte sekvens under fanen med titlen med det mønstrede belysningsværktøjsproduktnavn. Vælg indstillingen for at stimulere mønsteret for at få vist og justere den ønskede eksponeringsplacering.
Derefter justeres lysintensiteten til 60% og eksponeringstiden til 40 sekunder under LED-kontrolfanen og starter eksponeringsprocessen. Overvåg hydrogelforringelsen i realtid og Brightfield-tilstand for at sikre celleudslip. Hvis du vil indsamle den frigivne celle, skal du ændre mikroskopfilteret fra Brightfield til TRITC for at visualisere det eksponerede område af prøven med det blotte øje.
Når det udsatte område er placeret, skal du placere enden af slangen på det bestrålede sted og derefter ændre mikroskopfilteret tilbage til Brightfield for at overvåge cellehentning i realtid. Brug sprøjten, der er fastgjort til den anden ende af slangen, til forsigtigt at trække 200 mikroliter opløsning, der indeholder de frigivne celler, tilbage, og overfør opløsningen til et 1,5 millimeter centrifugerør til DNA-analyse eller plating. Forskellige UV-lys mikro mønstre blev brugt til celleudtrækning fra bulk hydrogels, som påvirkede morfologi af de frigivne celler.
UV-eksponeringen i et ringmønster resulterede i frigivelsen af hele kolonien indkapslet i en beskyttende PEG hydrogel. I modsætning hertil, ved at udsætte en del af eller hele kolonien til UV-lys, celler kunne udvindes enten som aggregerede celle klynger eller som frie individuelle celler. Celle såning tæthed og tykkelse af hydrogel er vigtige for celle indkapsling.
De tyndere hydrogeler resulterede i mikrokolonier med minimal koloni overlapning, mens hydrogels med øget tykkelse resulterede i overlappende kolonier, hvilket kan resultere i udvinding af flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsage krydskontaminering under udvinding på grund af lysmønsterets todimensionelle karakter. Når en topkoloni blev målrettet, den underliggende koloni blev også udvundet med det.
Virkningen af varierede UV-lysmikromønstre på celleens levedygtighed blev også vurderet. Når mikrokolonier blev udsat for kontrollerede doser AF UV-lys i enten et cirkulært eller krydsmønster, blev cellegendannelse og DNA-renhed ikke påvirket. Cellerne blev med succes hentet fra mikrowell arrays ved hjælp af denne tilgang, hvilket fremgik af de repræsentative konfokale mikroskopibilleder, hvor cellerne ved bestråling i cirkulære og ringmønster blev fjernet i det respektive mønster.
Efter udvinding fra mikrowell arrays blev celle levedygtigheden og DNA-mængden vurderet. Eksponeringsmønstrene påvirkede hverken det levedygtige celletal eller DNA-kvaliteten, hvilket indikerer, at levedygtige bakterieceller selektivt kunne hentes fra mikrowells med minimal skade, og deres DNA kunne isoleres ved høj renhed til downstream genomisk analyse. Kontroller altid, at hydrogelen er dannet, før du fjerner den perfluoralkylerede coverlip.
Præcision og pleje er nødvendig for at placere afstandsrum til hydrogelaflejring og bruge slangerne til udvinding af celler.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
