A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Direkta och indirekta odlingsmetoder för att studera biologiskt nedbrytbara implantatmaterial in vitro
Chapters
Summary April 15th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi introducerar tre metoder för direkt kultur, direkt exponeringskultur och exponeringskultur för att utvärdera in vitro-cytokompatibiliteten hos biologiskt nedbrytbara implantatmaterial. Dessa in vitro-metoder efterliknar olika interaktioner mellan in vivo-cellimplantat och kan tillämpas för att studera olika biologiskt nedbrytbara material.
Transcript
Direkta och indirekta odlingsmetoder för att studera biologiskt nedbrytbara implantatmaterial in vitro. Under de senaste decennierna har biologiskt nedbrytbara material undersökts i stor utsträckning för biomedicinska tillämpningar, såsom ortopediska, dental och hjärnskålen maxillofacial implantat. för att screena de biologiskt nedbrytbara materialen för biomedicinska tillämpningar är det nödvändigt att utvärdera dessa material i termer av in vitro-cellssvar, cytokompatibilitet och cytotoxicitet.
Standarder i Internationella standardiseringsorganisationen har använts i stor utsträckning vid utvärderingar av biomaterial. De flesta ISO-standarder fastställdes dock ursprungligen för att bedöma stiltoxiciteten hos icke-nedbrytbara material, vilket ger begränsat värde för screening av biologiskt nedbrytbara material. I den här videon kommer vi att introducera och diskutera tre olika kulturmetoder, nämligen direktkulturmetod, direkt exponeringskulturmetod och exponeringskulturmetod för utvärdering av in vitro-cytokompatibiliteten hos biologiskt nedbrytbara implantatmaterial.
Specifikt utvärderar den direkta odlingsmetoden interaktionerna mellan nysådda celler och implantaten. Direkt exponeringskultur efterliknar interaktionerna mellan de etablerade cellerna i kroppen och implantaten. Exponeringskulturen kännetecknar samspelet mellan etablerade celler och implantaten när de inte är i direkt kontakt med varandra utan i samma miljö där materialen bryts ned.
Denna video ger exempel på att använda dessa tre odlingsmetoder för att studera in vitro cytocompatibility av biologiskt nedbrytbara implantat material och deras interaktioner med benmärg-härledda mesenchymala stamceller. De in vitro-metoder som beskrivs i denna video efterliknar olika scenarier i in vivo-miljön, vilket breddar tillämpligheten och relevansen av in vitro cytocompatibility testning av olika material för olika biomedicinska tillämpningar. Vi följer ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Community vid University of California at Riverside för cell- och vävnadsskörd.
Cellkultur förberedelse. De tre kulturmetoderna som beskrivs i den här videon är i allmänhet tillämpliga för olika celltyper som är vidhäftande. Här kommer BMSC skördade från råttavvänjare att introduceras som ett exempel för cellodlingspreparat Skörda benmärgs-härledda mesenkymala stamceller från råttavvänjare.
Det schematiska diagrammet i den här figuren visar stegen för att skörda BMSC från råttavvänjare. Ta bort huden och muskeln och bindväven för att dissekera lårbenet ur den avlivade råttan. Placera lårbenen i ett koniskt rör på 15 ml som innehåller cellodlingsmedier.
Placera koniska rören på is tills celluttaget utförs. Överför benen till en Petri-maträtt i det biologiska säkerhetsskåpet. Skär ändarna av benet med hjälp av ett kirurgiskt blad och spola benmärgen i ett koniskt rör på 50 ml genom att tvätta benmärgshålan med cellodlingsmedier med en spruta med 25 1/2 gauge-nålen.
Filtrera cellupphängningen med ett 70 mikrometerfilter följt av centrifugering vid 126 gånger gravitationen i fem minuter för att få cellpelletsen Aspirate ut supernatant media och fylla på med 10 ml färsk media. Rör försiktigt upp och ner för att återanvända cellerna med en serologisk pipett på 10 ml. Pipettera fjädringen direkt på insidan av en T-75-kolv och tillsätt media för att få upp volymen till 25 ml.
Odla cellerna i en inkubator i en standard steril cellodlingsmiljö som är 37 grader Celsius, fuktad atmosfär med 5% koldioxid och 95% luft. Efter tre till sju dagar sköljer du bort de icke-vidhäftande cellerna genom att aspirera på de gamla medierna och fylla på med färska medier. Fortsätt att odla och mata cellerna med färska medier tills de är redo för cellpassage, frysning eller användning i ett experiment.
Provberedning och sterilisering. Sterilisera eller desinficera alla prover före cellkulturen. Steriliserings- eller desinfektionsmetoder för olika provtyper varierar beroende på materialens olika egenskaper.
I allmänhet, använd ultraviolett strålning för att desinficera biologiskt nedbrytbara metaller för in vitro-studier. Cellkulturmetoder. Det schematiska diagrammet i den här figuren visar stegen i den direkta kulturmetoden.
I denna video BBC odlades på en magnesium härledd platta placeras inuti brunnarna i en 12-väl vävnad-kultur behandlad platta som ett exempel för att illustrera kulturmetoden. Använd en 90% konfluentkolv för att bestämma cellkoncentrationen i cellupphängningen med hjälp av en hemocytometer. Späd cell suspensionen med färska medier till en föreskriven cellkoncentration som behövs för cellstudien in vitro.
Placera proverna i mitten av 12-brunnsvävnadskulturplattorna. Skölj odlingsplattorna med 2 ml PBS och 2 ml DMEM sekventiellt för att kalibrera osmotiskt tryck under sterila förhållanden. Tillsätt 3 ml av den utspädda cellavstängningen i varje brunn på de intressanta proverna.
Odla cellerna i en inkubator under normala cellodlingsförhållanden i 24 timmar. Det schematiska diagrammet i vanställd visar stegen i direkt exponerings kultur. Förbered cellupphängningen med de erforderliga koncentrationerna av celler baserat på den experimentella utformningen för olika celltyper och avsedda tillämpningar.
Skölj odlingsplattorna med 2 ml PBS och 2 ml DMEM sekventiellt för att kalibrera osmotiskt tryck under sterila förhållanden. Tillsätt 3 ml av den utspädda cellupphängningen i varje brunn. Odla cellerna i den fuktade inkubatorn under normala cellodlingsförhållanden i 24 timmar eller tills cellerna når 50%till 80%sammanflöde.
Efter 24 timmars sköljning, cellerna i brunnsplattan med PBS med hjälp av en pipett för att ta bort flytande döda celler. Placera de desinficerade eller steriliserade proverna direkt på de vidhäftade cellerna. Tillsätt 3 ml färsk media i varje brunn.
Odla cellerna under normala cellodlingsförhållanden i ytterligare 24 timmar. Det schematiska diagrammet i den här figuren visar stegen i exponeringskulturmetoden. De första stegen för cellberedning är desamma som direkt exponeringskultur.
Placera sedan proverna i brunnsinsatserna med en membranporstorlek på 0,4 mikrometer och placera brunnsinsatserna med proverna i varje brunn med cellerna. Odla cellerna under normala cellodlingsförhållanden i ytterligare 24 timmar. Postkulturteckentecken av celler.
För direkt odling och direkt exponeringskultur, fixera, fläcka, avbilda och analysera cellerna vidhäftande på både brunnsplattor och prover. För exponeringskultur, analysera cellerna som klibba på brunnsplattorna. Samla postkulturmedierna från varje brunn till ett motsvarande 15 ml koniskt rör för vidare analys.
Samla alla prover efter kultur för vidare analys. Skölj cellerna vidhäftande på både prover och brunnsplattor tre gånger med PBS. Tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd i varje brunnsplatta.
Sätt tillbaka locket på brunnsplattan och låt PFA reagera i 20 minuter. Efter 20 minuter, aspirera PFA och dispensera den i en avfallsflaska. Skölj brunnsplattan tre gånger med PBS för att ta bort PFA och överför avfallet till avfallsflaskan.
Förbered färgningsmedlens arbetslager Enligt tillverkarens instruktioner. Tillsätt 200 till 400 mikroliter utspädd Alexa Fluor 488 Phalloidin färgningsmedel till varje brunn för att täcka cellerna på brunnsplattan och provet. Linda brunnsplattan i aluminiumfolie för att förhindra ljusexponering och låt Alexa Fluor 488 Phalloidin reagera i 20 minuter vid rumstemperatur.
Samla alexa fluor 488 Phalloidin färgningsmedel och dispensera den i motsvarande avfallsflaska. Skölj väggplattorna tre gånger med PBS för att ta bort överskottet Alexa Fluor 488 Phalloidin och dispensera den använda PBS i motsvarande avfallsflaska. Tillsätt 200 till 400 mikroliter utspädd DAPI till varje brunn för att täcka cellerna i brunnen och på provet.
Linda brunnsplattan i aluminiumfolie och låt DAPI reagera i fem minuter vid rumstemperatur. Skölj brunnsplattan tre gånger med PBS och häll ut den använda PBS i motsvarande avfallsflaska. Efter färgning, avbilda cellerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
När det är möjligt, ta faskontrastbilder av celler utöver fluorescensbilder. Avbilda cellerna på de biologiskt nedbrytbara proverna så snart som möjligt eller omedelbart efter färgning för att undvika eller minska eventuella förändringar som orsakas av kontinuerlig nedbrytning av prover. För direkt kultur och direkt exponeringskultur, avbilda och utvärdera två typer av celler.
För det första, cellerna på proverna i direkt kontakt med proverna, och två, cellerna som fastnade på brunnsplattan som omger proverna i direkt kontakt med proverna enligt figuren. För exponeringskultur, som visas här, använd bildguiden när du tar fluorescensbilderna av celler för att avgöra om cellens svar skulle vara annorlunda som svar på provernas dynamiska nedbrytningsgradient. Avbilda och analysera celler som ligger i området i den inre ringen, 3,5 mm från mitten, och den yttre ringen, som är 7 mm från mitten separat.
För varje prov, och i odlingsplattorna, ta slumpmässigt minst fem bilder från varje intresseområde där cellerna antingen är indirekt kontakt eller indirekt kontakt med proverna på ett fördefinierat avstånd. Från alla cellbilder som erhållits från steg 4.3 kvantifierar du cellmorfologin genom att mäta cellspridningsområdet och bildförhållandet för bildanalys. Räkna antalet celler i varje bildområde.
Beräkna cell vidhäftningstätheten under direkta och indirekta kontaktförhållanden som antalet celler per enhetsområde. Postkulturanalyser av media och prover. Innan självfixering, samla postkulturmediet.
Mät postkulturmediets pH-värden i varje brunn omedelbart efter insamlingen med hjälp av en förkalibrerad pH-mätare. Efter föregående steg i pH-mätningen samlar och späder du ut mediet med hjälp av en önskvärd utspädningsfaktor för optimal mätning av jonkoncentrationer. Mät koncentrationerna av de joner av intresse i postkulturmediet med hjälp av en induktivt kopplad plasmaoptisk emissionsspektrometer förkortad ICP-OES.
Efter in vitro-cellstudien kan de biologiskt nedbrytbara proverna förändras i dimension, massa, ytmorfologi, mikrostruktur och sammansättning. Postkulturanalys av prover hjälper till att förstå nedbrytningsmekanismen för prover. Efter cellkulturen, ta fotografierna av proverna för att visa möjliga förändringar i provdimension, färg, morfologi och andra synliga egenskaper.
Torka eller dehydrera postkulturproverna och mät provmassan, dimensionen och volymen för att kvantifiera eventuella förändringar i massa, dimension och volym. Använd ett scanningelektronmikroskop för att karakterisera provernas mikrostruktur och morfologi. Använd energidispersiv röntgenspektroskopi och röntgendefragmentering för att karakterisera nedbrytningsprodukternas sammansättning och fas på proverna.
Använd FTIR eller ATR för att detektera den kemiska bindningen på provytor. Representativa resultat. Här visar figuren de representativa fluorescensbilderna av benmärgsbaserade stamceller under direkta och indirekta kontaktförhållanden med hjälp av olika odlingsmetoder.
Den här figuren visar exempeldata för kvantifierad cell vidhäftningsdensitet. Som visas i figur A har BMI i direkt kontakt med ZC21 i 24-timmarskulturen betydligt större cell vidhäftningstäthet än någon annan grupp. Som visas i figur B är BMSC-vidhäftningstätheten betydligt högre för ZC21-gruppen än magnesiumgruppen i det indirekta kontakttillståndet för direkt exponeringskultur.
Det visar dock ingen signifikant skillnad jämfört med T64 och cellerna kontrollerar endast grupper. Här visar figur A pH-värdet för postkulturmedier efter direkt exponeringskulturen och direktkulturen. För direktexponeringskulturen varierar mediets pH-värden från 8,3 till 8,4 för alla prover.
I den direkta kulturen varierar mediernas pH-värden från 7,9 till 8 i grupperna. Figur B visar magnesiumjonkoncentrationen i postkulturmediet. I både den direkta exponeringskulturen och den direkta kulturen är deras magnesiumjonkoncentrationer i ZC21- och magnesiumgrupperna betydligt högre än någon annan kontrollgrupp.
Denna siffra visar XRD-mönstren för ZSr41 och rent magnesium efter en tre dagars exponeringskultur. De kristallina faserna av olika kompositioner, såsom magnesium, zinkoxid och hydroxyapatit observerades. Här visar figur A överlägget av SEM-bilder och EDX-kartor över ytelementkompositionen för magnesiumoxidbelagd magnesium, och kontrollen av magnesiumsubstrat och glas efter 24 timmars direkt odling med BMSCs.
Figur B visar provytornas kvantitativa ytelementsammansättning, som indikerar olika depositioner som bildas under cellkulturen. Slutsatser. I den här videon introducerade vi tre olika in vitro-metoder för att utvärdera cytokompatibiliteten hos biologiskt nedbrytbara implantatmaterial baserat på olika experimentella mönster och avsedda tillämpningar. Interaktionerna mellan material och olika typer av celler kunde undersökas genom direktkulturmetod, direkt exponeringskulturmetod och exponeringskulturmetod.
Denna video har presenterat viktiga in vitro-metoder för att studera effekten av biologiskt nedbrytbara material tillsammans med deras nedbrytningsprodukter på cellbeteenden för en mängd olika medicinska implantatapplikationer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
