Login processing...

Journal / Bioengineering /

JoVE Journal
Bioengineering
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Bioengineering

Direkte og indirekte kulturmetoder for å studere biologisk nedbrytbare implantatmaterialer In Vitro

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Journal (Bioengineering)

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

A Test Bed to Examine Helmet Fit and Retention and Biomechanical Measures of Head and Neck Injury in Simulated Impact

Journal (Bioengineering)

A Test Bed to Examine Helmet Fit and Retention and Biomechanical Measures of Head and Neck Injury in Simulated Impact

Click here for the English version

Direkte og indirekte kulturmetoder for å studere biologisk nedbrytbare implantatmaterialer In Vitro

Article DOI: 10.3791/63065-v • 14:49 min

April 15th, 2022 •

Changlu Xu*¹, Yiqing Chen*¹, Jiajia Lin¹, Huinan H. Liu^1,2,3

¹Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, ²Department of Bioengineering, University of California, Riverside, ³Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

April 15th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi introduserer tre metoder for direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur for evaluering av in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer. Disse in vitro-metodene etterligner forskjellige in vivo celleimplantatinteraksjoner og kan brukes til å studere ulike biologisk nedbrytbare materialer.

Transcript

Direkte og indirekte kulturmetoder for å studere biologisk nedbrytbare implantatmaterialer in vitro. I løpet av de siste tiårene har biologisk nedbrytbare materialer blitt grundig utforsket for biomedisinske anvendelser, for eksempel ortopediske, tann- og kraniale maxillofaciale implantater. for å screene de biologisk nedbrytbare materialene for biomedisinske applikasjoner, er det nødvendig å evaluere disse materialene når det gjelder in vitro-celleresponser, cytokompatibilitet og cytotoksisitet.

Standarder i Den internasjonale standardiseringsorganisasjonen har blitt mye brukt i evalueringene av biomaterialer. Imidlertid ble de fleste ISO-standarder opprinnelig etablert for å vurdere stiltoksisiteten til ikke-nedbrytbare materialer, og ga dermed begrenset verdi for screening av biologisk nedbrytbare materialer. I denne videoen vil vi introdusere og diskutere tre forskjellige kulturmetoder nemlig direkte kulturmetode, direkte eksponeringskulturmetode og eksponeringskulturmetode for evaluering av in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer.

Nærmere bestemt evaluerer den direkte kulturmetoden interaksjonene mellom nylig frøceller og implantatene. Direkte eksponeringskultur etterligner interaksjonene mellom de etablerte cellene i kroppen og implantatene. Eksponeringskulturen karakteriserer samspillet mellom etablerte celler og implantatene når de ikke er i direkte kontakt med hverandre, men i samme miljø der materialene forringes.

Denne videoen gir eksempler på bruk av disse tre kulturmetodene for å studere in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer og deres interaksjoner med benmargsavledede mesenchymale stamceller. In vitro-metodene beskrevet i denne videoen etterligner forskjellige scenarier av in vivo-miljøet, og utvider anvendbarheten og relevansen av in vitro cytokompatibilitetstesting av forskjellige materialer for ulike biomedisinske applikasjoner. Vi følger en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Community ved University of California ved Riverside for celle- og vevshøsting.

Cellekultur forberedelse. De tre kulturmetodene som er beskrevet i denne videoen, gjelder vanligvis for forskjellige celletyper som følges. Her vil BMSC-er høstet fra rotteavvenning bli introdusert som et eksempel for cellekulturforberedelse Høsting av benmargsavledede mesenchymale stamceller fra rotteavvenninger.

Det skjematiske diagrammet i denne figuren viser trinnene for å høste BMSC-er fra rotte-avvenninger. Fjern hud og muskel og bindevev for å dissekere lårbenet ut av den euthanized rotten. Plasser lårbenene i et 15 ml konisk rør som inneholder cellekulturmedier.

Plasser de koniske rørene på isen til tiden for å utføre celleutvinning. Overfør beinene til en Petri-tallerken i det biologiske sikkerhetsskapet. Klipp endene av beinet ved hjelp av et kirurgisk blad og skyll benmargen i et 50 ml konisk rør ved å vaske benmargshulen med cellekulturmedier ved hjelp av en sprøyte med 25 1/2 gauge nål.

Filtrer cellefjæringen ved hjelp av et 70 mikrometer filter etterfulgt av sentrifugering ved 126 ganger tyngdekraften i fem minutter for å få cellepellets Aspirate ut supernatante medier og fyll på med 10 ml ferske medier. Pipette forsiktig opp og ned for å resuspendere cellene ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Pipette suspensjonen direkte på innsiden av en T-75 kolbe og legg til medier for å bringe volumet opp til 25 milliliter.

Kultur cellene i en inkubator i et standard sterilt cellekulturmiljø som er 37 grader Celsius, fuktet atmosfære med 5% karbondioksid og 95% luft. Etter tre til syv dager, skyll bort de ikke-tilhengercellene ved å aspirere de gamle mediene og fylle på med friske medier. Fortsett å dyrke og mate cellene med friske medier til de er klare for cellepassasje, frysing eller bruk i et eksperiment.

Prøvepreparering og sterilisering. Steriliser eller desinfiser alle prøvene før cellekulturen. Steriliserings- eller desinfeksjonsmetoder for forskjellige prøvetyper varierer avhengig av materialets forskjellige egenskaper.

Generelt, bruk ultrafiolett stråling for å desinfisere biologisk nedbrytbare metaller for in vitro-studier. Cellekultur metoder. Det skjematiske diagrammet i denne figuren viser trinnene i den direkte kulturmetoden.

I denne videoen ble BMSC dyrket på en magnesiumavledet plate plassert inne i brønnene til en 12-brønns vevskulturbehandlet plate som et eksempel for å illustrere kulturmetoden. Bruk en kolbeflaske på 90 % til å bestemme cellekonsentrasjonen i cellesuspensjonen ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn cellefjæringen ved hjelp av friske medier til en foreskrevet cellekonsentrasjon som trengs for cellestudiens in vitro.

Plasser prøvene i midten av de 12-brønns vevskulturplatene. Skyll kulturplatene med 2 ml PBS og 2 ml DMEM sekvensielt for å kalibrere det osmotiske trykket under sterile forhold. Tilsett 3 ml av den fortynnede cellefjæringen i hver brønn på prøvene av interesse.

Kultur cellene i en inkubator under standard cellekulturforhold i 24 timer. Det skjematiske diagrammet i disfigure viser trinnene i direkte eksponeringskultur. Forbered celleopphenget med de nødvendige konsentrasjonene av celler basert på eksperimentell design for forskjellige celletyper og tiltenkte applikasjoner.

Skyll kulturplatene med 2 ml PBS og 2 ml DMEM sekvensielt for å kalibrere det osmotiske trykket under sterile forhold. Tilsett 3 ml av den fortynnede cellefjæringen i hver brønn. Kultur cellene i den fuktede inkubatoren under standard cellekulturforhold i 24 timer eller til cellene når 50% til 80% samløp.

Etter 24 timers skylling, cellene i brønnplaten med PBS ved hjelp av en pipette for å fjerne flytende døde celler. Plasser de desinfiserte eller steriliserte prøvene direkte på de festede cellene. Tilsett 3 ml ferske medier i hver brønn.

Kultur cellene under standard cellekultur forhold i ytterligere 24 timer. Det skjematiske diagrammet i denne figuren viser trinnene i eksponeringskulturmetoden. Innledende trinn for celleforberedelse er de samme som direkte eksponeringskultur.

Deretter plasserer du prøvene i brønninnleggene med en membranporstørrelse på 0,4 mikrometer og plasserer brønninnleggene med prøvene i hver brønn med cellene. Kultur cellene under standard cellekultur forhold i ytterligere 24 timer. Postkultur karakterisering av celler.

For direkte kultur og direkte eksponeringskultur, fest, flekk, bilde og analyser cellene som følges på både brønnplater og prøver. For eksponeringskultur, analyser cellene som er festet til brønnplatene. Samle postkulturmediene fra hver brønn i et tilsvarende 15 ml konisk rør for videre analyse.

Samle alle prøvene etter kultur for videre analyse. Skyll cellene på begge prøvene og brønnplatene tre ganger ved hjelp av PBS. Tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd i hver brønnplate.

Sett lokket tilbake på brønnplaten og la PFA reagere i 20 minutter. Etter 20 minutter aspirerer du PFA og dispenserer den i en avfallsflaske. Skyll brønnplaten tre ganger med PBS for å fjerne PFA og overføre avfallet til avfallsflasken.

Forbered arbeidslagrene til fargestoffene i henhold til produsentens anvisninger. Tilsett 200 til 400 mikroliter fortynnet Alexa Fluor 488 Phalloidin fargestoff til hver brønn for å dekke cellene på brønnplaten og prøven. Pakk brønnplaten i aluminiumsfolie for å forhindre lyseksponering og la Alexa Fluor 488 Phalloidin reagere i 20 minutter ved romtemperatur.

Samle Alexa Fluor 488 Phalloidin fargingsmiddel og dispenser det inn i den tilsvarende avfallsflasken. Skyll veggplatene tre ganger ved hjelp av PBS for å fjerne overflødig Alexa Fluor 488 Phalloidin og dispenser den brukte PBS-en i den tilsvarende avfallsflasken. Tilsett 200 til 400 mikroliter fortynnet DAPI til hver brønn for å dekke cellene i brønnen og på prøven.

Pakk brønnplaten inn i aluminiumsfolie og la DAPI reagere i fem minutter ved romtemperatur. Skyll brønnplaten tre ganger med PBS og dispenser den brukte PBS-en i den tilsvarende avfallsflasken. Etter farging, bilde cellene ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

Når det er mulig, ta fasekontrastbilder av celler i tillegg til fluorescensbilder. Bilde cellene på de biologisk nedbrytbare prøvene så snart som mulig eller umiddelbart etter farging for å unngå eller redusere mulige endringer forårsaket av kontinuerlig nedbrytning av prøver. For direkte kultur og direkte eksponeringskultur, bilde og evaluere to typer celler.

En, cellene på prøvene i direkte kontakt med prøvene, og to, cellene festet seg på brønnplaten rundt prøvene i direkte kontakt med prøvene som vist på figuren. For eksponeringskultur, som vist her, bruk bildelinjen når du tar fluorescensbildene av celler for å avgjøre om cellens respons ville være forskjellig som svar på dynamisk nedbrytningsgradering av prøvene. Bilde og analyserer celler som ligger i området i den indre ringen, 3,5 mm fra midten og den ytre ringen, som er 7 mm fra midten separat.

For hvert utvalg, og mens du er i kulturplatene, tar du tilfeldig minst fem bilder fra hvert interesseområde der cellene enten er indirekte kontakt eller indirekte kontakt med prøvene på forhåndsdefinert avstand. Fra alle cellebildene hentet fra trinn 4.3 kvantifiserer du cellemorfologien ved å måle cellespredningsområdet og størrelsesforholdet for bildeanalyse. Tell antall celler i hvert bildeområde.

Beregn celleadhesjonstettheten under direkte og indirekte kontaktforhold som antall celler per enhetsområde. Postkulturanalyser av medier og prøver. Før selvfiksering, samle postkulturmediet.

Mål pH-verdiene til postkulturmediet i hver brønn umiddelbart etter innsamling ved hjelp av en forhåndskalibrert pH-måler. Etter det forrige trinnet i pH-måling, samle og fortynn mediet ved hjelp av en ønskelig fortynningsfaktor for optimale målinger av ionkonsentrasjoner. Mål konsentrasjonene av ionene av interesse i postkulturmediene ved hjelp av et induktivt koblet plasmaoptisk utslippsspektrometer forkortet som ICP-OES.

Etter in vitro-cellestudien kan de biologisk nedbrytbare prøvene endres i dimensjon, masse, overflatemorfologi, mikrostruktur og sammensetning. Postkulturanalyse av prøver bidrar til å forstå nedbrytningsmekanismen for prøver. Etter cellekulturen tar du bildene av prøvene for å vise mulige endringer i utvalgsdimensjon, farge, morfologi og andre synlige egenskaper.

Tørk eller dehydrer postkulturprøvene og mål prøvemassen, dimensjonen og volumet for å kvantifisere eventuelle endringer i masse, dimensjon og volum. Bruk et skanningselektronmikroskop for å karakterisere prøvenes mikrostruktur og morfologi. Bruk energidispergeringsspektroskopi og røntgenbrudd for å karakterisere sammensetningen og fasen av nedbrytningsproduktene på prøvene.

Bruk FTIR eller ATR til å oppdage kjemisk binding på prøveoverflater. Representative resultater. Her viser figuren de representative fluorescensbildene av benmargavledede stamceller under direkte og indirekte kontaktforhold ved hjelp av ulike kulturmetoder.

Denne illustrasjonen viser eksempeldataene for kvantifisert celleadhesjonstetthet. Som vist i figur A, i den 24 timers direkte eksponeringskulturen, har BMSCer i direkte kontakt med ZC21 betydelig større celleadhesjonstetthet enn noen annen gruppe. Som vist i figur B, i den indirekte kontakttilstanden til direkte eksponeringskultur, er BMSC-adhesjonstettheten betydelig høyere for ZC21-gruppen enn magnesiumgruppen.

Det viser imidlertid ingen signifikant forskjell sammenlignet med T64 og celler bare kontrollgrupper. Her viser figur A pH-verdien av postkulturmedier etter direkte eksponeringskultur og direkte kultur. For den direkte eksponeringskulturen varierer pH-verdiene til mediet fra 8,3 til 8,4 for alle prøver.

I den direkte kulturen varierer pH-verdiene til media fra 7,9 til 8 på tvers av gruppene. Figur B viser magnesiumionkonsentrasjonen i postkulturmediet. I både den direkte eksponeringskulturen og den direkte kulturen er deres magnesiumionkonsentrasjoner i ZC21- og magnesiumgruppene betydelig høyere enn noen andre kontrollgrupper.

Denne figuren viser XRD-mønstrene for ZSr41 og rent magnesium etter en tre dagers eksponeringskultur. De krystallinske fasene av forskjellige sammensetninger, som magnesium, sinkoksid og hydroksyapatitt ble observert. Her viser figur A overlegget av SEM-bilder og EDX-kart over overflateelementsammensetning for magnesiumoksidbelagt magnesium, og kontroll av magnesiumsubstrater og glass etter 24 timer med direkte kultur med BMSCer.

Figur B viser den kvantitative overflateelementsammensetningen av prøveflatene, noe som indikerer forskjellige avsetninger dannet under cellekulturen. Konklusjoner. I denne videoen introduserte vi tre forskjellige in vitro-metoder for evaluering av cytokompatibiliteten til biologisk nedbrytbare implantatmaterialer basert på forskjellige eksperimentelle design og tiltenkte applikasjoner. Samspillet mellom materialer og ulike typer celler kan undersøkes gjennom direkte kulturmetode, direkte eksponeringskulturmetode og eksponeringskulturmetode.

Denne videoen har presentert viktige in vitro-metoder for å studere effekten av biologisk nedbrytbare materialer sammen med nedbrytningsprodukter på celleatferd for en rekke medisinske implantatapplikasjoner.

X

Simple Hit Counter