Direkte og indirekte dyrkningsmetoder til undersøgelse af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer in vitro

Direkte og indirekte dyrkningsmetoder til undersøgelse af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer in vitro. I løbet af de sidste årtier er biologisk nedbrydelige materialer blevet grundigt udforsket til biomedicinske anvendelser, såsom ortopædiske, dentale og kraniale maxillofaciale implantater. For at screene de biologisk nedbrydelige materialer til biomedicinske anvendelser er det nødvendigt at evaluere disse materialer med hensyn til in vitro-celleresponser, cytokompatibilitet og cytotoksicitet.

Standarder i Den Internationale Standardiseringsorganisation er blevet anvendt i vid udstrækning i evalueringerne af biomaterialer. De fleste ISO-standarder blev imidlertid oprindeligt fastlagt for at vurdere stiltoksiciteten af ikke-nedbrydelige materialer, hvilket giver begrænset værdi til screening af bionedbrydelige materialer. I denne video vil vi introducere og diskutere tre forskellige kulturmetoder, nemlig direkte kulturmetode, direkte eksponeringskulturmetode og eksponeringskulturmetode til evaluering af in vitro-cytokompatibiliteten af bionedbrydelige implantatmaterialer.

Specifikt evaluerer den direkte dyrkningsmetode interaktionerne mellem nyfrøede celler og implantaterne. Direkte eksponeringskultur efterligner interaktionerne mellem de etablerede celler i kroppen og implantaterne. Eksponeringskultur karakteriserer interaktionerne mellem etablerede celler og implantaterne, når de ikke er i direkte kontakt med hinanden, men i det samme miljø, hvor materialerne nedbrydes.

Denne video giver eksempler på anvendelse af disse tre dyrkningsmetoder til at studere in vitro-cytokompatibiliteten af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer og deres interaktioner med knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller. De in vitro-metoder, der er beskrevet i denne video, efterligner forskellige scenarier i in vivo-miljøet og udvider anvendeligheden og relevansen af in vitro-cytokompatibilitetstesten af forskellige materialer til forskellige biomedicinske anvendelser. Vi følger en protokol godkendt af Institutional Animal Care and Use Community ved University of California ved Riverside til celle- og vævshøst.

Cellekultur forberedelse. De tre dyrkningsmetoder, der er beskrevet i denne video, er generelt anvendelige for forskellige celletyper, der er tilhængere. Her introduceres BMSC’er høstet fra rottevænninger som et eksempel på cellekulturforberedelse Høst af knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller fra rottefravænninger.

Det skematiske diagram i denne figur viser trinnene til høst af BMSC’er fra rottevænninger. Fjern hud og muskler og bindevæv for at dissekere lårbenet ud af den aflivede rotte. Placer lårbensknoglerne i et 15 ml konisk rør indeholdende cellekulturmedier.

Placer de koniske rør på is indtil tidspunktet for udførelse af celleekstraktion. Overfør knoglerne til en petriskål i det biologiske sikkerhedsskab. Skær enderne af knoglen ved hjælp af et kirurgisk blad, og skyl knoglemarven i et 50 ml konisk rør ved at vaske knoglemarvshulrummet med cellekulturmedier ved hjælp af en sprøjte med 25 1/2 gauge nålen.

Filtrer cellesuspensionen ved hjælp af et 70 mikrometer filter efterfulgt af centrifugering ved 126 gange tyngdekraften i fem minutter for at få cellepillerne Aspirer ud supernatantmedier og genopfyld med 10 ml friske medier. Pipetter forsigtigt op og ned for at resuspend cellerne ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Ophænget pipettere direkte på indersiden af en T-75-kolbe, og tilsæt medier for at bringe lydstyrken op på 25 ml.

Kultur cellerne i en inkubator i et standard sterilt cellekulturmiljø, der er 37 grader Celsius, befugtet atmosfære med 5% kuldioxid og 95% luft. Efter tre til syv dage skylles de ikke-klæbende celler væk ved at aspirere de gamle medier og genopfyldes med friske medier. Fortsæt med at dyrke og fodre cellerne med friske medier, indtil de er klar til cellepassage, frysning eller brug i et eksperiment.

Prøveforberedelse og sterilisering. Steriliser eller desinficer alle prøverne før cellekulturen. Steriliserings- eller desinfektionsmetoder for forskellige prøvetyper varierer afhængigt af materialernes forskellige egenskaber.

Generelt skal du bruge ultraviolet stråling til at desinficere biologisk nedbrydelige metaller til in vitro-undersøgelser. Cellekultur metoder. Det skematiske diagram i denne figur viser trinene i den direkte kulturmetode.

I denne video blev BMSC’er dyrket på en magnesiumafledt plade placeret inde i brøndene på en 12-brønds vævskulturbehandlet plade som et eksempel for at illustrere kulturmetoden. Brug en 90 % sammenflydende kolbe til at bestemme cellekoncentrationen i cellesuspensionen ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd cellesuspensionen ved hjælp af friske medier til en foreskrevet cellekoncentration, der er nødvendig for cellestudiet in vitro.

Placer prøverne i midten af de 12-brønds vævskulturplader. Skyl dyrkningspladerne med 2 ml PBS og 2 ml DMEM sekventielt for at kalibrere det osmotiske tryk under sterile forhold. Tilsæt 3 ml af den fortyndede cellesuspension i hver brønd på prøverne af interesse.

Kultur cellerne i en inkubator under standard cellekulturbetingelser i 24 timer. Det skematiske diagram i disfigure viser trinene i direkte eksponeringskultur. Forbered cellesuspensionen med de krævede koncentrationer af celler baseret på det eksperimentelle design til forskellige celletyper og tilsigtede anvendelser.

Skyl dyrkningspladerne med 2 ml PBS og 2 ml DMEM sekventielt for at kalibrere det osmotiske tryk under sterile forhold. Tilsæt 3 ml af den fortyndede cellesuspension i hver brønd. Kultur cellerne i den befugtede inkubator under standard cellekulturbetingelser i 24 timer, eller indtil cellerne når 50% til 80% sammenløb.

Efter 24 timers skylning skylles cellerne i brøndpladen med PBS ved hjælp af en pipette til at fjerne flydende døde celler. Anbring de desinficerede eller steriliserede prøver direkte på de klæbende celler. Tilsæt 3 ml friske medier i hver brønd.

Dyrkning af cellerne under standard cellekulturbetingelser i yderligere 24 timer. Det skematiske diagram i denne figur viser trinnene i eksponeringskulturmetoden. Indledende trin til celleforberedelse er de samme som direkte eksponeringskultur.

Læg derefter prøverne i brøndindsatserne med en membranporestørrelse på 0,4 mikrometer og læg brøndindsatserne med prøverne i hver brønd med cellerne. Dyrkning af cellerne under standard cellekulturbetingelser i yderligere 24 timer. Postkultur karakterisering af celler.

Til direkte dyrkning og direkte eksponeringskultur skal du rette, plette, afbilde og analysere cellerne klæbende på både brøndplader og prøver. Til eksponeringskultur analyseres cellerne, der klæber til brøndpladerne. Saml postkulturmedierne fra hver brønd i et tilsvarende 15 ml konisk rør til yderligere analyse.

Saml alle prøverne efter kultur til yderligere analyse. Skyl cellerne klæbende på både prøver og brøndplader tre gange ved hjælp af PBS. Tilsæt 1 ml 4% paraformaldehyd i hver brøndplade.

Sæt låget tilbage på brøndpladen og lad PFA’en reagere i 20 minutter. Efter 20 minutter aspirerer PFA og udleverer det i en affaldsflaske. Skyl brøndpladen tre gange med PBS for at fjerne PFA’en og overføre affaldet til affaldsflasken.

Forbered farvestoffernes arbejdslagre Følg producentens anvisninger. Tilsæt 200 til 400 mikroliter fortyndet Alexa Fluor 488 Phalloidinfarvningsmiddel til hver brønd for at dække cellerne på brøndpladen og prøven. Pak brøndpladen ind i aluminiumsfolie for at forhindre lyseksponering, og lad Alexa Fluor 488 Phalloidin reagere i 20 minutter ved stuetemperatur.

Saml Alexa Fluor 488 Phalloidin-farvningsmidlet, og dispenser det i den tilsvarende affaldsflaske. Skyl vægpladerne tre gange med PBS for at fjerne det overskydende Alexa Fluor 488 Phalloidin og dispensere den brugte PBS i den tilsvarende affaldsflaske. Tilsæt 200 til 400 mikroliter fortyndet DAPI til hver brønd for at dække cellerne i brønden og på prøven.

Pak brøndpladen ind i aluminiumsfolie, og lad DAPI’en reagere i fem minutter ved stuetemperatur. Skyl brøndpladen tre gange med PBS, og dispenser den brugte PBS i den tilsvarende affaldsflaske. Efter farvning skal du afbilde cellerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop.

Når det er muligt, skal du tage fasekontrastbilleder af celler ud over fluorescensbilleder. Forestil dig cellerne på de bionedbrydelige prøver så hurtigt som muligt eller umiddelbart efter farvning for at undgå eller reducere mulige ændringer forårsaget af kontinuerlig nedbrydning af prøver. Til direkte kultur og direkte eksponeringskultur, billede og evaluer to typer celler.

For det første, cellerne på prøverne i direkte kontakt med prøverne, og to, cellerne klæbede på brøndpladen omkring prøverne i direkte kontakt med prøverne som vist på figuren. For eksponeringskultur, som vist her, skal du bruge billedguiden, når du tager fluorescensbillederne af celler for at afgøre, om cellens respons ville være anderledes som reaktion på dynamisk nedbrydningsgradient af prøverne. Billede og analyser celler placeret i området inden for den indre ring, 3,5 mm væk fra midten, og den ydre ring, som er 7 mm væk fra midten separat.

For hver prøve, og mens de er i dyrkningspladerne, skal der tilfældigt tages mindst fem billeder fra hvert interesseområde, hvor cellerne enten er indirekte kontakt eller indirekte kontakt med prøverne i en foruddefineret afstand. Fra alle cellebilleder opnået fra trin 4.3 kvantificeres cellemorfologien ved at måle cellespredningsområdet og billedformatet til billedanalyse. Tæl antallet af celler i hvert billedområde.

Beregn celleadhæsionstætheden under direkte og indirekte kontaktbetingelser som antallet af celler pr. Arealenhed. Postkulturanalyser af medier og prøver. Før selvfiksering skal du indsamle postkulturmedierne.

Mål pH-værdierne for postkulturmedierne i hver brønd umiddelbart efter indsamling ved hjælp af en prækalibreret pH-meter. Efter det foregående trin i pH-måling opsamles og fortyndes mediet ved hjælp af en ønskelig fortyndingsfaktor for optimale målinger af ionkoncentrationer. Koncentrationerne af de ioner, der er af interesse for postkulturmedierne, måles ved hjælp af et induktivt koblet plasma-optisk emissionsspektrometer forkortet ICP-OES.

Efter in vitro-celleundersøgelse kan de bionedbrydelige prøver ændre sig i dimension, masse, overflademorfologi, mikrostruktur og sammensætning. Postkulturanalyse af prøver hjælper med at forstå nedbrydningsmekanismen for prøver. Efter cellekultur skal du tage fotografierne af prøverne for at vise mulige ændringer i prøvedimension, farve, morfologi og andre synlige egenskaber.

Tør eller dehydrer postkulturprøverne, og mål prøvens masse, dimension og volumen for at kvantificere eventuelle ændringer i masse, dimension og volumen. Brug et scanningselektronmikroskop til at karakterisere prøvernes mikrostruktur og morfologi. Brug energidispersiv røntgenspektroskopi og røntgenafbrydning til at karakterisere sammensætningen og fasen af nedbrydningsprodukterne på prøverne.

Brug FTIR eller ATR til at detektere den kemiske binding på prøveoverflader. Repræsentative resultater. Her viser figuren de repræsentative fluorescensbilleder af knoglemarvsafledte stamceller under direkte og indirekte kontaktbetingelser ved hjælp af forskellige dyrkningsmetoder.

Denne figur viser eksempeldataene for kvantificeret celleadhæsionstæthed. Som vist i figur A har BMSC’er i direkte kontakt med ZC21 i 24-timers direkte eksponeringskultur signifikant større celleadhæsionstæthed end nogen anden gruppe. Som vist i figur B er BMSC-vedhæftningstætheden signifikant højere for ZC21-gruppen end magnesiumgruppen i den indirekte kontaktbetingelse for kultur med direkte eksponering.

Det viser imidlertid ingen signifikant forskel sammenlignet med T64, og celler kontrollerer kun grupper. Her viser figur A pH-værdien af postkulturmedier efter den direkte eksponeringskultur og direkte kultur. For kulturen med direkte eksponering varierer pH-værdierne for medier fra 8,3 til 8,4 for alle prøver.

I den direkte kultur varierer pH-værdierne i medier fra 7,9 til 8 på tværs af grupperne. Figur B viser magnesiumionkoncentrationen i postkulturmedierne. I både den direkte eksponeringskultur og den direkte kultur er deres magnesiumionkoncentrationer i ZC21- og magnesiumgrupperne signifikant højere end nogen anden kontrolgruppe.

Denne figur viser XRD-mønstrene for ZSr41 og rent magnesium efter en tre dages eksponeringskultur. De krystallinske faser af forskellige sammensætninger, såsom magnesium, zinkoxid og hydroxyapatit blev observeret. Her viser figur A overlejringen af SEM-billeder og EDX-kort over overfladeelementær sammensætning for magnesiumoxidbelagt magnesium og kontrol af magnesiumsubstrater og glas efter 24 timers direkte dyrkning med BMSC’er.

Figur B viser den kvantitative overfladeelementariske sammensætning af prøvefladerne, hvilket indikerer forskellige aflejringer dannet under cellekulturen. Konklusioner. I denne video introducerede vi tre forskellige in vitro-metoder til evaluering af cytokompatibiliteten af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer baseret på forskellige eksperimentelle designs og tilsigtede anvendelser. Samspillet mellem materialer og forskellige typer celler kan undersøges ved hjælp af metoden med direkte dyrkning, dyrkningsmetoden med direkte eksponering og eksponeringskulturmetoden.

Denne video har præsenteret vigtige in vitro-metoder til at studere effekten af biologisk nedbrydelige materialer sammen med deres nedbrydningsprodukter på celleadfærd til en række medicinske implantatapplikationer.