Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Spatiotemporal subcellulär manipulation av mikrotubulicytoskelettet i det levande preimplantatoriska musembryot med hjälp av fotostatiner
Chapters
Summary November 30th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Typiska mikrotubulihämmare, som används i stor utsträckning i grundforskning och tillämpad forskning, har långtgående effekter på celler. Nyligen framkom fotostatiner som en klass av fotoväxlingsbara mikrotubulihämmare, som kan momentan, reversibel, spatiotemporalt exakt manipulation av mikrotubuli. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver tillämpningen av fotostatiner i ett 3D-levande preimplantatorembryo.
Transcript
Detta protokoll är det första i sitt slag som applicerar fotostatiner på det levande preimplantatoriska musembryot och gäller användningsområden för att använda ljusväxlande läkemedel på andra 3D-fysiologiska system. Ljusomkopplingsbara fotostatiner möjliggör manipulation av mikrotubuli tillväxt, i rum och tid, och omvandlas tillbaka till ett avstängt tillstånd. Oavsiktligt utsätta fotostatiner för blått ljus, före experimentet, kan aktivera dem i förtid.
Så vi rekommenderar att du arbetar i fullständigt mörker eller rött ljus hela tiden när du förbereder dina prover. Under strikta mörka förhållanden, med endast rött ljus för belysning, börja göra lager och mellanliggande arbetslösning av PST-1P i ultrarent vatten. Som beskrivs i textmanuskriptet.
Späd sedan PST-1P i färsk KSOM för att uppnå den slutliga koncentrationen på 40 M.To förbereda kammarbilden för levande avbildning, tillsätt 10 liter PST-1P-behandlad KSOM i mitten av en brunn för att bilda en halvklotformad droppe. För att förhindra att droppen avdunstar, täck den med tillräcklig mineralolja. Linda sedan löst in den beredda odlingsskålen i folie eller placera odlingsskålen i en icke-lufttät ogenomskinlig behållare i inkubatorn för att säkerställa ingen ljusexponering.
Efter överföring av embryon till pst-1P-behandlad KSOM-droppe, se till att embryon är grupperade i mitten av droppen och sedimenterade till botten av skålen. När nedsänkningsmållinsen är förberedd, montera kammarbilden på mikroskopet, inuti en miljökammare. Inställd på 37 C och 5% CO2, och i fullständigt mörker, för att säkerställa att alla PST-1Ps är i den inaktiva transkonfigurationen och att embryon kan sjunka till botten av skålen.
Använd en ficklampa med rött ljus för att placera objektivlinsen i kontakt med nedsänkningsmediet. Leta sedan upp kanten på mediets droppe och placera målet direkt över det. Använd live-scanning-läget och en 561 nm laser, lokalisera embryon i droppen.
Använd scenkontroller och live-scanning-läge för att ställa in start- och slutpunkter för att skaffa en z-stack av hela embryot. Justera lasereffektinställningarna upp till maximalt 5% enligt din signal. Och ställ in digital förskjutning till högst 0,900, enligt din signal, för att optimera utseendet på EB3-dTomato-kometer.
Minimera bakgrundsbruset. Ställ in nålhålet på 2 m. Pixelupplösning vid 512 till 512.
Och pixelns uppehållstid vid 3, 15 s. Och ställ in zoomen på 2x. Skaffa en z-stack av hela embryot med 1 m sektionsintervall för att bedöma områdena för mikrotubuli tillväxt i hela organismen.
För EB3-dTomato kometspårningsexperiment, öppna 3D z-stackbilden, öka zoomen till tre gånger. Och rita en rektangulär ROI runt det specifika subcellulära intresseområdet. Skaffa sedan time lapse-filmen för ett enda z-plan, med hjälp av de inställda parametrarna, med ett tidsintervall på 500 ms.
För att aktivera PST-1P, byt till en 405 nm-laser och skaffa en annan time-lapse, med lasern inställd på 10% effekt, pinhole öppnade maximalt, pixelupplösning på 512 med 512, pixelns uppehållstid på 3,15 s, zoom på tre gånger, med ett tidsintervall på 500 ms och ställ in 20 ramar som ska förvärvas. Omedelbart efter aktiveringen, byt tillbaka till 561 nm laser och upprepa förvärvet, som visats tidigare, för att bekräfta förlusten av EB3-dTomato-kometer efter aktivering av PST-1P. Nu, för att vända PST-1P tillbaka till sitt inaktiva transtillstånd, koppla in en 514 nm laser och skaffa en annan time-lapse med inställda parametrar.
För att visualisera återhämtningen av EB3-dTomato-kometer, byt tillbaka till 561 nm laser och upprepa förvärvet. I obehandlade kontrollembryon, före belysning med en 405 nm laser, var EB3-dTomato-signalen hög inom hela cellens cytoplasma, utom kärnområdet. Efter belysning upptäcktes inte förändringar i signalen.
Indikerar att 405 nm-lasern inte orsakade fotoskador på embryot eller mikrotubulidynamiken. Under PST-1P-behandling av embryon i 16-cellstadiet, under strikta mörka förhållanden, detekterades starkt EB3-dTomato-uttryck i 3D-bilden, vilket visade att inaktiv PST-1P inte framkallade hämning av mikrotubuli polymerisation under mörka förhållanden. Före aktivering av PST-1P bekräftade time-lapse-avbildningen av ett enda z-plan starkt EB3-dTomato-uttryck och mikrotubulipolymerisation i en subcellulär region.
Efter 405 nm ljusaktivering, inom några sekunder, detekterades en minskning av EB3-dTomato kometsignalen. Och återhämtning av signalen uppnåddes vid avaktivering av PST-1P, med användning av en 514 nm laser. Embryona mikroinjicerade med EB3-dTomato och inkuberade med PST-1P visade normal embryonal potential och utvecklades till blastocyststadiet.
Och normal mikrotubuli dynamik under mitos. Indikerar icke-toxicitet hos en aktiv PST-1P till embryot. I de förvärvade time-lapse-filmerna uppträdde EB3-dTomato-märkning som kometliknande strukturer och möjliggjorde spårning av växande mikrotubulifilament.
I PST-1P-behandlade embryon, som hölls under mörka förhållanden, utgick enskilda EB3-dTomato-kometer från interfasbron, som fungerar som ett icke-centrosomalt mikrotubuliorganiserande centrum i det tidiga musembryot. En t-stack visar EB3-dTomato-kometer i området för interfasbron. Efter aktivering av PST-1P reducerades EB3-dTomato-kometer vid basen av interfasbron och i t-stacken.
Kom ihåg att vitt ljus kan aktivera PST-1P i förtid. Så använd endast röda ljuskällor för synlighet. Grönt ljus inaktiverar också PST-1P, så undvik att använda gröna fluorescerande etikettmarkörer.
Denna teknik har använts i drosophila, amöba, möss och flera in vitro-system för att rikta in sig på mikrotubulitillväxt för att studera cellmigration och vävnadsbildning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
