Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Ons protocol richt zich op de effecten van regulerende RNA-bindende eiwitten op microRNA-biogenese en rijping, rechtstreeks uit celculturen. De methode die we beschrijven kan worden uitgevoerd met gemeenschappelijke celkweekreagentia en is relatief snel. Deze methode kan belangrijk zijn om de fenotypische effecten van microRNA’s en hun doelwitten in verschillende soorten eukaryote cellen te bestuderen.

Normale of ziekte-achtige cellen kunnen worden gebruikt. Het is belangrijk om cellijnen te kiezen die vatbaar zijn voor transfectie, adequate transfectie- en inductiecontroles uit te voeren om de veranderingen in doelaffiniteit door luciferaseactiviteit te observeren. Om te beginnen, onderhoud de cellen in DMEM, hoog glucosesupplement in petrischalen van 100 millimeter en incubeer de cellen op 37 graden Celsius in een bevochtigde, gecontroleerde atmosfeerincubator met 5% koolstofdioxide.

Om aanhangende cellen los te maken, incubeer het met trypsine-EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Om transfecties uit te voeren, mengt u 200 nanogram DNA en 1,25 microliter transfectiereagens in 100 microliter van het kweekmedium en voegt u het transfectiemengsel toe aan de cellen. Incubeer vervolgens de cellen met de transfectiemengsels gedurende vier uur bij 37 graden Celsius.

Vervang vervolgens het medium door een medium met 10% FBS en incubeer nog eens 24 uur voordat u de antibiotica toevoegt voor selectie. Om pFLAG-HuR en MT-pFLAG in HeLa te transfecteren, selecteert u cellen door de concentratie geneticïne te verhogen van 100 microgram per milliliter naar 1000 microgram per milliliter, waardoor stabiele cellijnen worden gegenereerd. Bevestig vervolgens overexpressie met kwantitatieve PCR met behulp van specifieke primers voor HuR-mRNA.

Transfecteer de plasmiden in HeLa-Cre-cellen met 40 nanogram pTK-Renilla, vervolgens pRD miR 17-92, genereer HeLa-Cre miR 17-92 en selecteer met één microgram per milliliter puromycine. Vervolgens transfect HeLa-Cre miR 17-92 met pTK-Renilla en pmirGLO RAB1B 3’UTR of pmirGLO afzonderlijk gecrambled 1B 3’UTR. Selecteer vervolgens met penicilline en streptomycine, wat resulteert in de generatie van luc RAB1B en luc scrambled.

Transfecteer vervolgens de cellen met pFLAG-HuR of MT-PFLAG zoals ze eerder hebben aangetoond. Ga verder met celkweek met HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 scrambled, HeLa-Cre miR 17-92 HuR en HeLa-Cre miR 1792 HuR lock totdat ongeveer 80% van de samenvloeiing is bereikt. Induceer vervolgens met één microliter doxycycline gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en houd ook alle cellen zonder doxycycline als controles voor dezelfde periode.

Om verschillende luminescentie-intensiteiten te kwantificeren en te vergelijken, gebruikt u de dual luciferase reporter assay kit. Voordat u met de test begint, ontdooit u luciferase-assay-oplossingen en laat u ze bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens de mix Stop en Glo door 200 microliter van het substraat te mengen in 10 milliliter luciferasetestbuffer twee.

Meng vervolgens 10 milliliter luciferasetestbuffer twee in het amber gemene luciferase-assaysubstraat twee om de mix, LAR II, voor te bereiden en goed te schudden. Breng daarna de oplossingen over naar centrifugebuizen van 15 milliliter die eerder zijn geïdentificeerd en beschermd tegen licht. Voer vervolgens de luminescentiemetingen uit met behulp van apparatuur zoals Synergy en meet uitgedrukt luciferase als relatieve lichteenheden en exporteer vervolgens de resultaten naar een spreadsheet voor verdere statistische analyse.

Voer normalisatie van firefly luciferase-activiteit uit door de controle Renilla en plot dat als relatieve lichteenheden in een grafiek terwijl u herhaalt voor groepen met en zonder doxycycline-inductie. Overexpressie van HuR bij transfectie van pFLAG-HuR werd bevestigd in HeLa, BCPAP en HEK293T cellijn, en er werd waargenomen dat HuR-overexpressie in deze cellen de expressie van miR19A stimuleert. Een sterke vermindering van luciferaseactiviteit werd waargenomen met RAB1B 3’UTR bij verhoogde miR19A- en miR19B-expressie van pRD miR 17-92, in vergelijking met HeLa-Cre-cellen.

De transfectie van pFLAG-HuR in HeLa-cellen veranderde de luciferase-activiteit niet. Overexpressie van HuR, in combinatie met doxycycline-suppletie die de expressie van de miR 17-92-cluster stimuleert, verminderde echter de luciferase-activiteit verder. Na bevestiging van de rol van het RNA-bindende eiwit in microRNA-rijping, zullen celkinetiek en celcyclusanalyse belangrijk zijn om de belangrijkste veranderingen te begrijpen die door het eiwit in microRNA’s worden bevorderd.