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June 16, 2022
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私たちのプロトコルは、細胞培養から直接、マイクロRNAの生合成と成熟に対する調節RNA結合タンパク質の影響に対処します。我々が説明する方法は、一般的な細胞培養試薬を用いて行うことができ、比較的高速である。この方法は、さまざまな種類の真核細胞におけるマイクロRNAとその標的の表現型効果を研究するために重要です。
正常または疾患様細胞を使用することができる。ルシフェラーゼ活性による標的親和性の変化を観察するためには、トランスフェクションに適した細胞株を選択し、適切なトランスフェクションおよび誘導制御を行うことが重要です。まず、細胞をDMEM、高グルコースサプリメントを100ミリメートルのペトリ皿に維持し、5%二酸化炭素を含む加湿された制御された雰囲気インキュベーターで摂氏37度で細胞をインキュベートします。
接着細胞を剥離するには、トリプシン-EDTA溶液と一緒に摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。トランスフェクションを行うには、100マイクロリットルの培養液に200ナノグラムのDNAと1.25マイクロリットルのトランスフェクション試薬を混合し、トランスフェクション混合物を細胞に加えます。次に、細胞をトランスフェクション混合物とともに摂氏37度で4時間インキュベートします。
次に、培地を10%FBSを含む培地と交換し、さらに24時間インキュベートしてから、選択のために抗生物質を追加します。pFLAG-HuRおよびMT-pFLAGをHeLaにトランスフェクションするには、ジェネティシンの濃度を1ミリリットルあたり100マイクログラムから1ミリリットルあたり1000マイクログラムに増加させて細胞を選択し、安定した細胞株を生成します。その後、HuR mRNAの特異的プライマーを用いた定量PCRで過剰発現を確認した。
HeLa-Cre細胞のプラスミドを40ナノグラムのpTK-Renillaでトランスフェクトし、次にpRD miR 17-92をトランスフェクトし、HeLa-Cre miR 17-92を生成し、1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシンで選択します。次に、HeLa-Cre miR 17-92をpTK-RenillaおよびpmirGLO RAB1B 3’UTRまたはpmirGLOスクランブル1B 3’UTRで別々にトランスフェクトした。次に、ペニシリンおよびストレプトマイシンを用いて選択し、luc RAB1Bおよびlucスクランブルの生成をもたらした。
次に、前に示したように、pFLAG-HuRまたはMT-PFLAGで細胞をトランスフェクションします。HeLa-Cre miR 17-92 luc、HeLa-Cre miR 17-92 スクランブル、HeLa-Cre miR 17-92 HuR、およびHeLa-Cre miR 1792 HuRロックを使用して、コンフルエントの約80%に達するまで細胞培養に進みます。次に、1マイクロリットルのドキシサイクリンを摂氏37度で30分間誘導し、ドキシサイクリンを含まないすべての細胞を同じ期間コントロールとして保持します。
さまざまな発光強度を定量して比較するには、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキットを使用してください。アッセイを開始する前に、ルシフェラーゼアッセイ溶液を解凍し、室温で放置します。次に、200マイクロリットルの基質を10ミリリットルのルシフェラーゼアッセイバッファー2液に混合してStopとGloのミックスを調製する。
次に、10ミリリットルのルシフェラーゼアッセイバッファー2をルシフェラーゼアッセイ基質2の琥珀色の卑劣なものに混合して、ミックスLAR IIを調製し、よく振とうします。その後、溶液を以前に特定され、光から保護された15ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、Synergyなどの機器を使用して発光測定値を実行し、相対光単位として発現されたルシフェラーゼを測定し、結果をスプレッドシートにエクスポートしてさらに統計分析します。
コントロールRenillaによるホタルルシフェラーゼ活性の正規化を実行し、それをドキシサイクリン誘導の有無にかかわらずグループについて繰り返しながら、グラフィックに相対光単位としてプロットします。HeLa、BCPAP、およびHEK293T細胞株において、pFLAG-HuRのトランスフェクション時のHuRの過剰発現が確認され、これらの細胞におけるHuRの過剰発現がmiR19Aの発現を刺激することが観察された。HeLa-Cre細胞と比較して、pRD miR 17-92からのmiR19AおよびmiR19B発現の増加時に、RAB1B 3’UTRでルシフェラーゼ活性の強い低下が観察されました。
HeLa細胞におけるpFLAG-HuRのトランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性を変化させなかった。しかしながら、HuRの過剰発現は、miR 17−92クラスターのドキシサイクリン補充刺激発現と相まって、ルシフェラーゼ活性をさらに低下させた。マイクロRNAの成熟におけるRNA結合タンパク質の役割を確認した後、マイクロRNAにおけるタンパク質によって促進される主要な変化を理解するためには、細胞動態と細胞周期解析が重要になります。
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イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。
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Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).
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