Samodling av murina tunntarmsepitelorganoider med medfödda lymfoida celler

Detta protokoll ger ett viktigt verktyg för att studera interaktionerna mellan intestinala immunceller och epitelet och att dissekera hur dessa interaktioner kan reglera i tarmhomeostas och inflammation. Den största fördelen med denna teknik är den utsökta mängden experimentell kontroll som underlättas av reduktion in vitro-modellen, som kan användas för att ta itu med frågor i epitel- och immunbiologi. Detta system har redan använts för att bestämma ILC1: s roll i expansionen av CD44-positiva epitelkrypter och har potential att ytterligare främja vår förståelse av inflammationsmedierade gastrointestinala sjukdomar.

Till att börja med, placera termisk tvärbindning basal extracellulär matris på is för att tina och förvärma en standard vävnadsodlingsbehandlad 24-brunnsplatta genom att placera den i en 37-graders Celsius inkubator. Ta sedan bort plattan som innehåller organoider från inkubatorn och kassera mediet från brunnen som ska passeras. Tillsätt sedan 500 mikroliter iskall avancerad DMEM F12 till brunnarna, och använd en P-1000-spets, skörda organoiderna från alla brunnar till ett 15-milliliters rör.

Skölj botten av brunnarna med 250 till 300 mikroliter iskall avancerad DMEM F12, så att inga organoider finns kvar i brunnen och poolas i 15-millilitersröret som innehåller skördade organoider. Resuspend den en till två dagar gamla skördade organoidpelleten i en milliliter iskall avancerad DMEM F12. Förbelägga ett 1,5-milliliter rör med PBS2 per medfött lymfoidt cellreplikatprov och sedan använda en förbelagd PBS2-spets fördela cirka 100 till 200 organoider i röret.

Använd en PBS2-belagd P-1000-spets och tillsätt en volym på minst 500 ILC1s beräknat från sorteringssteget till det PBS2-belagda 1,5-millilitersröret som innehåller organoiderna. Snurra ner ILC1 och organoider vid 300 G i fem minuter vid fyra grader Celsius och se till att undvika centrifuger med liten diameter, eftersom de kommer att dra cellerna längs kanten av rörets inre istället för att skapa en pellets vid rörets spets. Ta sedan bort supernatanten långsamt och försiktigt utan att störa pelletsen och lägg provet på is.

Medan du håller röret på en kall yta, resuspendera organoiderna och ILC i 30 mikroliter termisk tvärbindning basal extracellulär matris minst 10 till 15 gånger för att säkerställa jämn fördelning. Applicera 30 mikroliter per brunn av ILC-organoider i den termiska tvärbindningen basal extracellulär matris på en förvärmd 24- eller 48-brunnsplatta för att bilda en enda kupol. Placera sedan plattan direkt i inkubatorn i 10 till 20 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.

Tillsätt sedan 550 mikroliter komplett ILC1-medium per brunn med önskade experimentella cytokiner eller blockerande antikroppar och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar. Efter 24 timmar, ta försiktigt bort plattan från inkubatorn och låt plattan sitta i en vävnadsodlingskåpa i en minut för att säkerställa att lymfocyterna är sedimenterade. Ta bort 200 till 250 mikroliter media och placera den i en tom brunn på en 24-brunnsplatta.

Använd ett inverterat mikroskop, kontrollera supernatanten för att säkerställa att inga lymfocyter avlägsnades. Om supernatanten är klar, tillsätt 300 mikroliter färskt ILC1-medium till samkulturen i den ursprungliga brunnen. Om lymfocyter är närvarande i supernatanten, centrifugera vid 300 till 400 G i tre till fem minuter vid fyra grader Celsius och återsuspendera pelletsen i 300 mikroliter färskt ILC1-medium.

Tillsätt sedan cellsuspensionen till de återstående 200 till 250 mikroliter media i den ursprungliga brunnen. Utför nedströms analys med immunofluorescens, flödescytometri eller FACS-rening av målpopulationer till lysbuffert för genuttrycksanalys av en encells- eller bulk-RNA-sökning eller RT-qPCR som beskrivs i texten. Efter framgångsrikt slutförande av passagen avslöjade friska och robusta organoidkulturer att de nyligen isolerade krypterna skulle bilda spirande kryptstrukturer inom två till fyra dagar.

Flödescytometrisk analys utfördes för att isolera tunntarmS-ILC1 från ROR gamma-T-murina transgena reporterlinjen, och det förväntade ILC-räkningsområdet befanns vara 350 till 3 500 isolerade celler. Efter sådd med organoider kan samkulturer visualiseras genom immunokemi cytokemi. Konfokalmikroskopi avslöjade bilderna av tunntarmsorganoider som odlas ensamma och i närvaro av ILC1.

Immunocytokemisk färgning avslöjar närvaron av CD45-positiv ILC1 i närheten av Zonula occludens protein-1-positiva epitelceller i organoid ILC1-samkulturer. Flödescytometri visade att epitelcellulär vidhäftningsmolekyl markerar tarmepitelceller i organoider, medan CD45 markerar ILC1. Flödescytometrisk plot och immunokemi avslöjade ökat uttryck av CD44 i tarmepitelceller när de samodlingades med ILC1.

RT-qPCR-studierna visar att ILC1 samkultur specifikt uppreglerade CD44-variant 6, som hämmades av TGF-beta 1, 2, 3 neutraliserande antikroppar och uppreglerades av rekombinant TGF-beta 1 i tunntarmsorganoider-bara kulturer. Det är viktigt att vara försiktig vid manipulation av organoiderna för att säkerställa att hela strukturerna bibehålls och för att kontrollera att strukturerna har pelleterat tillräckligt efter centrifugering. Genom att öka systemets komplexitet genom att lägga till andra immun- och icke-immunkomponenter kan detta in vitro-system användas för att ta itu med ytterligare frågor i tarmbiologin.