Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

De zebravis is uniek in zijn intrinsieke vermogen om veel verschillende weefseltypen te regenereren, waaronder de RPE. Dit protocol kan worden gebruikt om moleculaire routes te identificeren die RPE-regeneratie en RPE-ziektegerelateerde mechanismen aansturen. Veelzijdigheid is een belangrijk voordeel van deze methodiek.

Naast het bestuderen van RPE-regeneratie, kan dit protocol worden gebruikt om RPE-degeneratieve processen en de effecten van RPE-schade op aangrenzende weefsels in het oog te onderzoeken. Zoogdieren, inclusief mensen, zijn niet in staat om grote RPE-verwondingen als gevolg van trauma of degeneratieve ziekten te herstellen. Het gebruik van zebravissen als een hulpmiddel om RPE pro-regeneratieve factoren te ontdekken, is een belangrijke stap in de richting van het bevorderen van RPE-regeneratie bij zoogdieren.

Om een verse 10 millimolaire MTZ-oplossing te bereiden, vijf dagen na de bevruchting, voegt u MTZ-poeder toe aan systeemwater zonder PTU en mengt u grondig door krachtig te schudden gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Koel 10 millimolaire MTZ-oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur op een tafelrotator of shaker. Om zebravislarven van het rpe65a:nsfB-eGFP-transgen te screenen, scheidt u transgene eGFP-positieve larven van niet-transgene eGFP-negatieve larven met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop met een excitatielaser van 488 nanometer.

Wek gescreende larven onmiddellijk op door direct te pipetteren in een petrischaaltje met verse 1,5X PTU zonder tricaïne. Na voltooiing van de screening, scheid de eGFP-positieve larven verder in twee groepen petrischalen, één groep om MTZ-behandeling te krijgen en één groep om de niet-aangegeven controle te zijn. Verwijder vervolgens het retinale pigmentepitheel door 1,5x PTU uit de geableerde behandelingsschotels te verwijderen en voeg de vers gemaakte 10 millimolaire MTZ-oplossing toe.

Verwijder ook 1,5x PTU uit de niet-opgeluchte controleschalen en voeg vers systeemwater toe zonder PTU. Verwijder de 10 millimolaire MTZ-oplossing na precies 24 uur en voeg vers systeemwater toe zonder PTU. Ververs het verse systeemwater zonder PTU op de MTZ-negatieve gerechten.

Screen eGFP positieve larven op vier dagen na de bevruchting. De eGFP is vier dagen na de bevruchting zichtbaar, maar lijkt op de vijfde dag zwakker dan de signaalintensiteit. Plaats eGFP-positieve larven in platen met zes putten in plaats van petrischalen met een dichtheid van niet meer dan 10 larven per put voor farmacologische behandeling.

Wijs afzonderlijke platen met zes putten aan voor ablated en niet-aangegeven larven. Bepaal het volume van 15 micromolaire IWR-1 of volume-afgestemde DMSO-voertuigcontrolevoorbehandelingen die nodig zijn en aliquot 1,5X PTU in conische buizen dienovereenkomstig. Voeg IWR-1-voorraad toe aan 1,5x PTU voor een uiteindelijke concentratie van 15 micromolaire IWR-1.

Voeg een overeenkomend volume DMSO-voorraad toe aan 1,5x PTU. Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen. Verwijder 1,5x PTU uit de eGFP-positieve larven in zes-well platen en voeg vijf milliliter per put vers gemaakte 0,06% DMSO of 15 micromolaire IWR-1 behandelingen toe.

Ablate de RPE de volgende dag. Bepaal vijf dagen na de bevruchting het volume farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen die nodig zijn voor zowel niet-aangegeven als geableerde zesputplaten en aliquot geschikte volumes zoet systeemwater zonder PTU of 10 millimolar MTZ-oplossing in conische buizen. Voeg IWR-1 en DMSO stockoplossingen toe aan de respectievelijke conische buizen zoals eerder uitgevoerd.

Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen. Verwijder 0,06% DMSO en 15 micromolaire IWR-1 voorbehandelingen in 1,5X PTU van aangewezen niet-gebleerde en geableerde zes-well platen. Vul aan met het juiste verse systeemwater zonder PTU- en MTZ-oplossingsbehandelingen.

Verwijder 0,06% DMSO en 15 micromolaire IWR-1 behandelingen in 10 millimolaire MTZ-oplossing na precies 24 uur en vul aan met behandelingen in vers systeemwater zonder PTU. Vul 0,06% DMSO en 15 micromolaire IWR-1-behandelingen aan in zoet systeemwater zonder PTU op de niet-aangegeven zesputtenplaat. Monitor het succes en de omvang van ablatie in vivo met behulp van doorgelaten lichtverlichting op een stereomicroscoop voor larvaal onderhoud post-genetische ablatie.

Als u het interessante RPE-gebied of de ROI wilt genereren met Fiji, opent u een acht-bits TIFF-afbeelding, heroriënteert u de afbeelding zodat de dorsale zijde omhoog is en distal wordt achtergelaten door afbeelding te kiezen, te transformeren en horizontaal om te draaien. Kies voor de laatste opdracht de optie die het beste past bij de directionaliteit die nodig is voor die afbeelding. Start de ROI manager door te kiezen voor analyse, tools, ROI manager.

Gebruik afbeelding, zoom en schakel tussen de DAPI- en Brightfield-kanalen. Gebruik sneltoetsen voor efficiëntie. Identificeer het punt waarop de apicale kant van de RPE grenst aan de punt van het buitenste begrenzingsmembraan en gebruik dit anatomische oriëntatiepunt als het ROI-startpunt.

Maak de RPE ROI met het gereedschap polygoonselecties op de Fiji-werkbalk met behulp van zowel de DAPI- als Brightfield-afbeeldingskanalen en de beeldzoomfunctie om apicale en basale RPE-grenzen te identificeren. Breng de dorsale en ventrale uiteinden van de ROI naar een scherp punt in plaats van af te stompen of af te ronden. Voeg de ROI toe door in de ROI manager op toevoegen te klikken.

Sla het ROI-bestand op door meer te kiezen en bespaar binnen de ROI-manager. Dubbelklik op de rpegen. m-bestand te openen in het editorvenster.

Onder de door de gebruiker gedefinieerde variabele sectie van de rpegen. m-bestand, voer de maplocaties in voor mappen met de roi-bestanden, de tiff-afbeeldingsbestanden en waar uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen. Voer de groepsnaam in voor het matbestand dat moet worden geëxporteerd en de locatie van het Brightfield-kanaal in de TIFF-afbeeldingsstapel.

Voer het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB te klikken. Na het opslaan van het MAT-bestand verschijnt er een figuur met drie panelen en wordt deze ook opgeslagen als PDF in de uitvoermap voor elke afbeeldingsrun. Wacht totdat deze kwaliteitscontrole-PDF’s zijn opgeslagen in de uitvoermap en het laatste cijfer is verdwenen.

Open de afzonderlijke PDF’s en controleer of alle ROI’s overeenkomen met de Brightfield-afbeeldingen. Dubbelklik op de rpegen_permplot. m bestand te openen in een nieuw editortabblad.

Voer onder sectie door één gebruiker gedefinieerde variabelen de maplocatie in voor de uitvoermap met de MAT-bestanden van het uitvoeren van de rpegen. m script. Voer elke MAT-bestandsnaam in die moet worden geladen.

Voer dit gedeelte van het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu te klikken. Voer in deel twee de namen van de twee groepen in voor een statistische vergelijking in de variabelen gegevens A en B en geef het aantal herhalingen van permutatiesimulaties in de variabele reps aan. Slechts 2.000 herhalingen werden gebruikt voor deze demo om de verwerkingstijd te verkorten.

Voer dit gedeelte van het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu te klikken. Voer heatmap-figuur- en groepsresultaten en P-waardesecties onafhankelijk van elkaar uit met behulp van de knop Sectie uitvoeren. Hele mount schade van een vijf dagen na de bevruchting larve vertoonde heldere transgene expressie in de RPE op het moment van screening op genetische ablatie.

Transversale cryosectie van niet-geobleerde zesdaagse post-bevruchtingslarve toonde aan dat transgene expressie beperkt was tot volwassen RPE-cellen met de helderste expressie beperkt tot de centrale 2/3 van de RPE. Pijlpunten geven apicale microvilli aan. Transversale cryosectie van een geableerde eendaagse post-verwondingslarve onthulde verstoring van de eGFP-positieve celmorfologie.

Pijlen geven pyknotische kernen aan. Hele mount schade van niet-aangegeven zeven dagen na de bevruchting larven vertoonde RPE pigmentatie door het hele oog en ablated twee dagen post-verwonding larven vertoonden een ablatiezone afwezig pigment in de centrale RPE. Een plot gegenereerd met behulp van RpEGEN vertoonde gelijkenis tussen de niet-gesynchroniseerde negendaagse dmso- en IWR-1-groepen na de bevruchting over de lengte van de RPE.

De plot toonde een algehele lichtere pixelintensiteit in de ablated vierdaagse DMSO- en IWR-1-groepen na het letsel, die het lichtst leken in de geableerde IWR-1 in vergelijking met elke andere behandelingsgroep. Verschillen in centrale RPE-pigmentatie waren significant bij het vergelijken van met Ablated IWR-1 behandelde larven met met ablated DMSO behandelde controles. Met behulp van dit zebravisablatieparadigma zijn we in staat geweest om verschillende moleculaire signaalroutes te identificeren, zoals windsignalering die we hier hebben laten zien, die kritieke regulatoren zijn van RPE-regeneratie.