Biology
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Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre
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Summary March 2nd, 2022
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Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.
Transcript
Le poisson-zèbre est unique dans sa capacité intrinsèque à régénérer de nombreux types de tissus différents, y compris l’EPR. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les voies moléculaires qui conduisent à la régénération de l’EPR et aux mécanismes liés à la maladie de l’EPR. La polyvalence est l’un des principaux avantages de cette méthodologie.
En plus d’étudier la régénération de l’EPR, ce protocole peut être utilisé pour examiner les processus dégénératifs de l’EPR et les effets des dommages causés par l’EPR sur les tissus adjacents de l’œil. Les mammifères, y compris les humains, sont incapables de réparer les blessures d’EPR importantes résultant d’un traumatisme ou d’une maladie dégénérative. L’utilisation du poisson-zèbre comme outil pour découvrir les facteurs pro-régénération de l’EPR est une étape importante vers la promotion de la régénération de l’EPR chez les mammifères.
Pour préparer une solution fraîche de MTZ de 10 millimolaires, cinq jours après la fertilisation, ajoutez de la poudre de MTZ à l’eau du système sans PTU et mélangez soigneusement en agitant vigoureusement pendant une heure à 37 degrés Celsius. Refroidir la solution MTZ de 10 millimolaires pendant une heure à température ambiante sur un rotateur ou un agitateur de table. Pour dépister les larves de poisson zèbre du transgène rpe65a:nsfB-eGFP, séparez les larves transgéniques positives eGFP des larves négatives eGFP non transgéniques à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent avec un laser d’excitation de 488 nanomètres.
Réveillez immédiatement les larves filtrées en pipetant directement dans une boîte de Pétri avec 1,5X PTU frais sans tricaïne. À la fin du dépistage, séparez davantage les larves positives à l’eGFP en deux groupes de boîtes de Pétri, un groupe pour recevoir un traitement MTZ et un groupe pour être le témoin non atténué. Ensuite, ablation de l’épithélium pigmentaire rétinien en retirant 1,5X PTU des plats de traitement ablés et ajouter la solution de MTZ de 10 millimolaires fraîchement préparée.
Retirez également 1,5X PTU des plats de contrôle non atablés et ajoutez de l’eau fraîche du système sans PTU. Retirez la solution MTZ de 10 millimolaires après exactement 24 heures et ajoutez de l’eau fraîche du système sans PTU. Changez l’eau fraîche du système sans PTU sur les plats négatifs MTZ.
Dépister les larves eGFP positives quatre jours après la fécondation. L’eGFP est visible quatre jours après la fécondation, mais apparaît plus faible que l’intensité du signal le cinquième jour. Placer les larves eGFP positives dans des plaques de six puits au lieu de boîtes de Petri à une densité ne dépassant pas 10 larves par puits pour un traitement pharmacologique.
Désigner des plaques séparées de six puits pour les larves ablées et non ablées. Déterminer le volume de 15 prétraitements de contrôle de véhicule DMSO micromolaires IWR-1 ou DMSO adaptés au volume nécessaires et aliquote 1,5X PTU dans des tubes coniques en conséquence. Ajouter la souche IWR-1 à 1,5X PTU pour une concentration finale de 15 IWR-1 micromolaires.
Ajoutez un volume correspondant de stock de DMSO à 1,5X PTU. Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés. Retirer 1,5 fois la PTU des larves positives à l’eGFP dans des plaques à six puits et ajouter cinq millilitres par puits de traitements 0,06% DMSO fraîchement préparés ou 15 traitements IWR-1 micromolaires.
Ablate le RPE le lendemain. Cinq jours après la fécondation, déterminer le volume de traitements pharmacologiques et de contrôle des véhicules nécessaires pour les plaques de six puits non abrasées et ablées et aliquote les volumes appropriés d’eau douce du système sans PTU ou de solution de MTZ de 10 millimolaires dans des tubes coniques. Ajoutez des solutions mères IWR-1 et DMSO aux tubes coniques respectifs comme cela a été effectué précédemment.
Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés. Retirer 0,06 % de DMSO et 15 prétraitements micromolaires IWR-1 dans 1,5 X PTU des plaques désignées à six puits non ablées et ablées. Réapprovisionnez avec l’eau douce appropriée du système sans traitements de solution PTU et MTZ.
Retirer 0,06% de DMSO et 15 traitements IWR-1 micromolaires dans une solution de MTZ de 10 millimolaires après exactement 24 heures et reconstituer avec des traitements dans de l’eau douce du système sans PTU. Reconstituer 0,06 % de DMSO et 15 traitements IWR-1 micromolaires dans de l’eau douce du système sans PTU sur la plaque non atablée de six puits. Surveiller le succès et l’étendue de l’ablation in vivo à l’aide de l’éclairage lumineux transmis sur un stéréomicroscope pour l’entretien larvaire post-ablation génétique.
Pour générer la région RPE d’intérêt ou roi à l’aide de Fidji, ouvrez une image TIFF huit bits, réorientez l’image de sorte que la face dorsale soit vers le haut et que la distale soit laissée en choisissant l’image, transformez et retournez horizontalement. Pour la dernière commande, choisissez l’option qui convient le mieux à la directionnalité nécessaire pour cette image. Démarrez le gestionnaire de retour sur investissement en choisissant analyser, outils, gestionnaire de retour sur investissement.
Utilisez l’image, le zoom et basculez entre les canaux DAPI et Brightfield. Utilisez des raccourcis clavier pour plus d’efficacité. Identifiez le point auquel le côté apical de l’EPR est adjacent à l’extrémité de la membrane limitante externe et utilisez ce repère anatomique comme point de départ du retour sur investissement.
Créez le retour sur investissement RPE avec l’outil de sélection de polygones de la barre d’outils Fidji à l’aide des canaux d’image DAPI et Brightfield et de la fonction de zoom d’image pour identifier les limites RPE apicales et basales. Amenez les extrémités dorsale et ventrale du roi à un point pointu plutôt que de les émousser ou de les arrondir. Ajoutez le roi en cliquant sur ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement.
Enregistrez le fichier ROI en choisissant plus et enregistrez dans le gestionnaire ROI. Double-cliquez sur le rpegen. m à ouvrir dans le volet de l’éditeur.
Sous la section variable définie par l’utilisateur du rpegen. m, entrez les emplacements de répertoire pour les dossiers contenant les fichiers roi, les fichiers image tiff et où les fichiers de sortie doivent être enregistrés. Entrez le nom du groupe pour le fichier mat à exporter et l’emplacement du canal Brightfield dans la pile d’images TIFF.
Exécutez le script en cliquant sur le bouton Exécuter dans le menu de l’éditeur en haut de MATLAB. Après avoir enregistré le fichier MAT, une figure à trois panneaux apparaîtra et sera également enregistrée au format PDF dans le répertoire de sortie de chaque exécution d’image. Attendez que ces pdf de contrôle qualité aient été enregistrés dans le dossier de sortie et que le dernier chiffre ait disparu.
Ouvrez les fichiers PDF individuels et vérifiez que tous les retours sur investissement correspondent aux images Brightfield. Double-cliquez sur le rpegen_permplot. m à ouvrir dans un nouvel onglet de l’éditeur.
Sous la section Variables définies par un utilisateur, entrez l’emplacement du répertoire du dossier de sortie contenant les fichiers MAT de l’exécution du rpegen. m script. Entrez chaque nom de fichier MAT à charger.
Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu de l’éditeur. Dans la deuxième section, entrez les noms des deux groupes pour une comparaison statistique dans les variables de données A et de données B et désignez le nombre de répétitions de simulation de permutation dans la variable reps. Seulement 2 000 répétitions ont été utilisées pour cette démo afin de réduire le temps de traitement.
Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu de l’éditeur. Exécutez les résultats de la figure de carte thermique et du groupe et les sections de valeur P indépendamment à l’aide du bouton Exécuter la section. Les dommages causés à la monture d’une larve de cinq jours après la fécondation ont montré une expression transgénique brillante dans l’EPR au moment du dépistage de l’ablation génétique.
La cryosection transversale de la larve non ajourée de six jours après la fécondation a montré que l’expression transgénique était limitée aux cellules EPR matures, l’expression la plus brillante étant confinée aux 2/3 centraux de l’EPR. Les pointes de flèche indiquent des microvillosités apicales. La cryosection transversale d’une larve ablée d’un jour après une blessure a révélé une perturbation de la morphologie cellulaire positive de l’eGFP.
Les flèches indiquent les noyaux pyknotiques. Les dommages de monture entiers des larves non accolées de sept jours après la fécondation ont montré une pigmentation de l’EPR dans tout l’œil et les larves ablées deux jours après la blessure ont montré une zone d’ablation sans pigment dans l’EPR centrale. Un diagramme généré à l’aide de RpEGEN a montré une similitude entre les groupes DMSO et IWR-1 non atténués de neuf jours après la fécondation sur toute la longueur de l’EPR.
Le graphique a montré une intensité globale de pixels plus légère dans les groupes DMSO et IWR-1 de quatre jours ablés après la blessure, qui semblaient les plus légers dans l’IWR-1 ablée par rapport à tout autre groupe de traitement. Les différences dans la pigmentation centrale de l’EPR étaient significatives lorsque l’on comparait les larves traitées par IWR-1 ablée aux témoins traités par DMSO ablée. En utilisant ce paradigme d’ablation du poisson-zèbre, nous avons pu identifier plusieurs voies de signalisation moléculaire, telles que la signalisation du vent que nous avons montrée ici, qui sont des régulateurs critiques de la régénération RPE.
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