Generering af luftvejsepitelcelle luft-væske-grænsefladekulturer fra humane pluripotente stamceller

Denne protokol er nyttig, fordi den giver let at følge trin, der giver mulighed for generering af funktionelle luftvejsepitelceller, som derefter kan bruges til at studere forskellige aspekter af luftvejsbiologi. Den største fordel ved denne protokol er evnen til at generere mange funktionelle luftvejsepitelcellekulturer, samtidig med at man undgår vanskelighederne med at opnå og dyrke primære luftvejsceller. Demonstration af proceduren vil være Taylor Matte, en kandidatstuderende fra vores laboratorium.

Begynd med at optø et tilstrækkeligt volumen 3D-matrix på is. Opbevar den på is, indtil den er klar til brug. Optø et hætteglas med tidligere kryopreserverede enkeltcellesuspensioner af iBC’er ved at inkubere det i et 37 grader Celsius vand- eller perlebad, indtil der ikke er synlige frosne medier.

Brug en fem milliliter serologisk pipette til at overføre cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør. Tilsæt seks til 10 ml DMEM / F12 dråbevis til cellesuspensionen. Bland og centrifuger forsigtigt ved 300 RCF i fem minutter for at pelletere cellerne.

Aspirer supernatanten og resuspend cellepillen i en milliliter basalcellemedium med en P1000 mikropipette. Forbered en 10 mikroliter aliquot og udfør et celleantal. Cellerne centrifugeres ved 300 RCF i fem minutter.

Aspirere supernatanten og resuspender cellerne med en tæthed på 4.000 celler pr. Mikroliter i den tidligere optøede ved 3D-matrix med en P1000 mikropipette. Med en P200 mikropipette tilsættes en dråbe af matrixopløsningen svarende til ca. 25 til 50 mikroliter til bunden af hver brønd i en 12-brønd vævskulturbehandlet plade. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i ca. 15 minutter.

Tilsæt derefter nok basalcellemedium til hver brønd for fuldt ud at nedsænke dråben ved hjælp af en fem milliliter serologisk pipette. Sæt pladen tilbage til en befugtet inkubator. Foder celler hver anden dag ved hjælp af frisk basalcellemedium.

Tilsæt frisk medium til siden af brønden med en fem milliliter serologisk pipette, og pas på ikke at forstyrre celledråben. Optø et tilstrækkeligt volumen af 3D-matrixen på is. Opbevar den på is, indtil den er klar til brug.

Efter ca. fem til syv dages inkubering af kulturplader aspireres mediet fra hver brønd, hvorefter der ved hjælp af en P1000 mikropipette tilsættes en milliliter dispase II direkte på sfæroiderne for at adskille sig fra matrixens dråbe. Placer pladen i 37 grader Celsius inkubator i 10 til 15 minutter. Brug en P1000 mikropipette til at blande dispasen ved at pipettere op og ned to gange og bryde store klumper af 3D-matrixen op.

Sæt pladen tilbage til 37 grader Celsius i yderligere 30 til 40 minutter, så matrixen kan opløses fuldstændigt. Når dråben af 3D-matrixen ikke længere er synlig under lysmikroskopet, tilsættes de frit flydende sfæroider til et 15 ml konisk rør ved hjælp af en fem milliliter serologisk pipettespids. Der tilsættes DMEM/F12 til et slutvolumen på 10 ml pr. konisk rør, og centrifuger ved 200 RCF i tre minutter for at pelletere sfæroiderne.

Aspirere supernatanten og tilsæt en milliliter 0,05% trypsin for hver indledende dråbe dissocieret. Inkuberes ved 37 grader Celsius, triturerer det hvert andet til tredje minut. Evaluer opløsningen med lysmikroskopet hvert par minutter.

Når mere end 90% af sfæroiderne er blevet dissocieret til enkeltceller, tilsættes 10% føtalt bovint serum til trypsin. Cellerne filtreres gennem en 40 mikrometer cellestam og centrifugeres ved 300 RCF i fem minutter. Udfør et celleantal og resuspend cellerne jævnt med en tæthed på 400 celler pr. Mikroliter optøet 3D-matrix.

Undgå at indføre luftbobler. Resuspend så mange dråber som nødvendigt til downstream-applikation. Gentag denne proces for hver brønd.

Efter 10 til 14 dage efter den seneste passage dissocieres sfæroiderne til en enkeltcellesuspension som demonstreret tidligere og udfører et celleantal. Resuspend cellerne i sorteringsbuffer. Dette vil være den største befolkning.

Overfør en lille aliquot på 25 til 50 mikroliter til et separat rør. Dette vil være den mindre befolkning. Konjugeret anti-NGFR-antistof tilsættes til hovedcellepopulationen.

Tilsæt isotypekontrolantistof til den mindre cellepopulation. Beskyt cellerne mod lys og hold dem på is i 30 minutter intermitterende Triturér cellerne for at forhindre pelletering. Efter 30 minutter skal du tilføje sorteringsbufferen til hvert rør af celler.

Centrifuge celler ved 300 RCF i fem minutter. Aspirer supernatanten, resuspend de pelleterede celler i sorteringsbufferen og tilsæt levende eller død celleplet. Ved hjælp af en passende NGFR-positiv gatingstrategi skal du sortere nok NGFR-positive celler til nødvendige downstream-applikationer.

Forbered 6,5 millimeter porøse membranindsatser ved at tilføje en 200 mikrolitermatrix til det apikale kammer i henhold til producentens anvisninger. Placer den ved 37 grader Celsius i mindst to timer før nødvendigt. Opsuge belægningsmatrixen fra insertets apikale kammer.

Tilsæt 500 mikroliter af basalcellemediet til det basolaterale kammer. Resuspend mindst 30.000 sorterede NGFR-positive celler i 100 til 200 mikroliter Basal Cell Medium og overfør til det apikale kammer ved hjælp af en P200 mikropipette. Gentag for de resterende brønde.

Placer pladen i en befugtet 37 grader Celsius inkubator. Om to til tre dage aspireres apikale og basolaterale kamre og fodres med frisk basalcellemedium. Overvåg det apikale kammer dagligt med lysmikroskopi.

Når celler når mere end 80% sammenløb, skal du erstatte basalcellemedium med ALI-differentieringsmedium i både apikale og basolaterale kamre. Beskyt ALI-differentieringsmediet mod lys ved at holde mediebeholdere pakket ind i folie og ved at slukke for loftslys, når det er muligt. Den næste dag aspireres mediet fra det apikale kammer og udsætter således den apikale overflade for luft.

Udskift ALI-differentieringsmediet i det basolaterale kammer hver anden til tredje dag. Overvåg kulturens udseende hver anden til anden dag. Sug forsigtigt enhver akkumuleret væske fra det apikale kammer uden at forstyrre cellelaget.

Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter PBS uden calcium eller magnesium til det apikale kammer for at fjerne snavs eller slim. Inkuberes ved 37 grader Celsius i 10 minutter, og opsuges derefter PBS forsigtigt. Vurder TEER for epitelintegritet.

Efter syv til 10 dages lufteksponering skal du observere for udseendet af multicilia ved hjælp af lysmikroskopi. Afhængigt af det planlagte eksperiment og udlæsning kan celler analyseres efter 14 til 28 dages lufteksponering. Efter 10 til 14 dage med den seneste 3D-kulturpassage dissocieres sfæroiderne til enkeltcellesuspension som demonstreret tidligere.

Udfør et celletal, resuspend cellesuspensionen i kryopræserveringsmedium i et kryofil. Anbring kryovirale stoffer i en beholder for at sikre et stabilt fald i temperaturen. Og overfør til minus 80 grader Celsius i 24 til 48 timer efterfulgt af overførsel til minus 150 grader Celsius til langtidsopbevaring.

Med denne gating-teknik var 28% af levende enkeltceller NGFR-positive. Efter to dage var individuelle celler oprindeligt let identificerbare og havde et langstrakt spindelformet udseende. Efter yderligere to dage dannede cellerne et sammenflydende og løst pakket monolag.

I løbet af de efterfølgende dage til uger dannede cellerne et tæt pakket, stærkt cellulært epitellag. Og efter syv til 10 dage var der en klar fremkomst af at slå cilia og slimproduktion. TEER af prøver blev målt, og resultaterne lignede målinger af primære luftvejsepitelcellekontrolprøver.

Efterfølgende fiksering med paraformaldehyd og immunomærkning til kanoniske luftvejsepitelcellemarkører blev udført for MUC5AC og acetyleret alfa-tubulin blandt andre. Efter denne protokol kan forskere generere et stort antal patientafledte luftvejsepitelcellekulturer for at vurdere forskellige aflæsninger, herunder dem, der tester funktionerne i basale, sekretoriske og multicilierede celler i både sygdom og sundhed.