Developmental Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generering av Airway Epitelial Cell Air-Liquid Interface Kulturer fra Human Pluripotent Stamceller
Chapters
Summary June 14th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Nylige fremskritt i menneskeskapte pluripotente stamcelledifferensieringsprotokoller tillater trinnvis avledning av organspesifikke celletyper. Her gir vi detaljerte trinn for vedlikehold og utvidelse av iPSC-avledede luftveisbasalceller og deres differensiering i et mucociliary epitel i luft-væske grensesnittkulturer.
Transcript
Denne protokollen er nyttig fordi den gir enkle å følge trinn som tillater generering av funksjonelle luftveis epitelceller, som deretter kan brukes til å studere ulike aspekter av luftveisbiologi. Den største fordelen med denne protokollen er evnen til å generere mange funksjonelle luftveis epitelale cellekulturer samtidig som man unngår vanskelighetene med å skaffe og dyrke primære luftveisceller. Å demonstrere prosedyren vil være Taylor Matte, en avgangsstudent fra laboratoriet vårt.
Begynn med å tine et tilstrekkelig volum 3D-matrise på is. Hold den på is til den er klar til bruk. Tine et hetteglass med tidligere kryopreserverte encellede suspensjoner av iBO-er ved å inkubere det i et 37 graders Celsius vann- eller perlebad til det ikke er synlige frosne medier.
Bruk en fem milliliter serologisk pipette, overfør cellefjæringen til et 15 milliliter konisk rør. Tilsett seks til 10 milliliter DMEM/F12 dropwise til celleopphenget. Bland forsiktig og sentrifuger ved 300 RCF i fem minutter for å pellet cellene.
Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i en milliliter Basal Cell Medium med en P1000 mikropipette. Forbered en 10 mikroliter aliquot og utfør et celleantall. Sentrifuger cellene ved 300 RCF i fem minutter.
Aspirer de supernatante og resuspend cellene med en tetthet på 4000 celler per mikroliter i den tidligere tinte ved 3D-matrise med en P1000 mikropipette. Med en P200 mikropipette, legg til en dråpe av matriseløsningen som tilsvarer ca. 25 til 50 mikroliter til bunnen av hver brønn av en 12-brønns vevskulturbehandlet plate. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i ca. 15 minutter.
Tilsett deretter nok basalcellemedium til hver brønn for å nedsenke dråpen helt ved hjelp av en fem milliliter serologisk pipette. Returner platen til en fuktet inkubator. Fôr celler annenhver dag ved hjelp av fersk Basal Cell Medium.
Tilsett friskt medium til siden av brønnen med en fem milliliter serologisk pipette, pass på at du ikke forstyrrer dråpen av celler. Tin et tilstrekkelig volum av 3D-matrisen på is. Hold den på is til den er klar til bruk.
Etter omtrent fem til syv dager med inkubering av kulturplater, aspirer mediet fra hver brønn, og bruk deretter en P1000 mikropipette, legg til en milliliter dispase II direkte på sfæroidene for å dissosiere fra matrisens dråpe. Plasser platen i 37 grader Celsius inkubator i 10 til 15 minutter. Bruk en P1000 mikropipette, bland dispase ved å pipettere opp og ned to ganger, bryte opp store klumper av 3D-matrisen.
Returner platen til 37 grader Celsius i ytterligere 30 til 40 minutter, slik at matrisen kan oppløses helt. Når dråpen av 3D-matrisen ikke lenger er synlig under lysmikroskopet, legg de fritt flytende sfæroidene til et 15 milliliter konisk rør ved hjelp av en fem milliliter serologisk pipettespiss. Tilsett DMEM/F12 for et sluttvolum på 10 milliliter per konisk rør og sentrifuge ved 200 RCF i tre minutter for å pellets sfæroidene.
Aspirer supernatanten og tilsett en milliliter 0,05% trypsin for hver første dråpe som er dissosiert. Inkuber ved 37 grader Celsius, triturere det hvert annet til tre minutter. Evaluer løsningen med lysmikroskopet med noen få minutter.
Når mer enn 90% av sfæroider har blitt dissosiert til enkeltceller, tilsett 10% foster bovint serum til trypsin. Filtrer cellene gjennom en 40 mikrometer cellesil og sentrifuger ved 300 RCF i fem minutter. Utfør et celleantall og resuspender cellene jevnt med en tetthet på 400 celler per mikroliter av tint 3D-matrise.
Unngå å introdusere luftbobler. Resuspend så mange dråper som nødvendig for nedstrøms søknad. Gjenta denne prosessen for hver brønn.
Etter 10 til 14 dager av den siste passasjen, dissosier sfæroidene til en enkelt celle suspensjon som demonstrert tidligere og utføre et celleantall. Koble cellene på nytt i sorteringsbufferen. Dette vil være hovedbefolkningen.
Overfør en liten aliquot på 25 til 50 mikroliter til et eget rør. Dette vil være den mindre befolkningen. Tilsett konjugert anti-NGFR antistoff til hovedcellepopulasjonen.
Tilsett isotypekontrollantistoff til den mindre cellepopulasjonen. Beskytt cellene mot lys og hold dem på is i 30 minutter periodisk Triturate cellene for å forhindre pelletering. Etter 30 minutter legger du til sorteringsbufferen i hvert rør av celler.
Sentrifuger celler ved 300 RCF i fem minutter. Aspirer den supernatante, resuspend pelleted cellene i sorteringsbufferen og legg til levende eller død celle flekk. Bruk en passende NGFR-positiv gatingstrategi, sorter nok NGFR-positive celler for nødvendige nedstrømsapplikasjoner.
Forbered 6,5 millimeter porøse membraninnlegg ved å legge til en 200 mikrolitermatrise til det apikale kammeret i henhold til produsentens instruksjon. Plasser den på 37 grader Celsius i minst to timer før nødvendig. Aspirer beleggmatrisen fra innsatsens apikale kammer.
Tilsett 500 mikroliter av Basal Cell Medium til det basolaterale kammeret. Resuspend minst 30.000 sorterte NGFR positive celler i 100 til 200 mikroliter Basal Cell Medium og overføre til det apikale kammeret ved hjelp av en P200 mikropipette. Gjenta for de resterende brønnene.
Plasser platen i en fuktet 37 grader Celsius inkubator. Om to til tre dager aspirerer aspirat apikale og basolaterale kamre og spiser med friskt Basal Cell Medium. Overvåk det apikale kammeret daglig med lysmikroskopi.
Når celler når mer enn 80% samløp, erstatt Basal Cell Medium med ALI differensieringsmedium i både apikale og basolaterale kamre. Beskytt ALI-differensieringsmediet mot lys ved å holde mediebeholdere pakket inn i folie og ved å slå av overheadlys når det er mulig. Neste dag aspirerer du mediet fra det apikale kammeret, og utsetter dermed den apikale overflaten for luft.
Bytt ut ALI-differensieringsmediene i basolateralkammeret annenhver til tre dager. Overvåk kulturutseendet hver en til to dager. Aspirer forsiktig eventuell akkumulert væske fra det apikale kammeret uten å forstyrre cellelaget.
Tilsett forsiktig 100 mikroliter PBS uten kalsium eller magnesium til det apikale kammeret for å fjerne rusk eller slim. Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter og deretter forsiktig aspirere PBS. Vurder TEER for epitelintegritet.
Etter syv til ti dager med lufteksponering, observere for utseendet av multicilia ved hjelp av lysmikroskopi. Avhengig av planlagt eksperiment og avlesning, kan celler analyseres etter 14 til 28 dager med lufteksponering. Etter 10 til 14 dager med den siste 3D-kulturpassasjen, dissosier sfæroidene til encellet suspensjon som vist tidligere.
Utfør et celleantall, resuspender cellefjæringen i kryopreserveringsmedium i en kryolegeme. Plasser kryovarier i en beholder for å sikre en jevn temperaturfall. Og overfør til minus 80 grader Celsius i 24 til 48 timer etterfulgt av overføring til minus 150 grader Celsius for langsiktig lagring.
Med denne gatingteknikken var 28% av levende enkeltceller NGFR-positive. Etter to dager var individuelle celler i utgangspunktet lett identifiserbare og hadde et langstrakt spindelformet utseende. Etter to dager dannet cellene en konfluent og løst pakket monolayer.
I løpet av de påfølgende dagene til ukene dannet cellene et tett pakket, svært cellulært epitellag. Og etter syv til ti dager var det en klar fremvekst av å slå cilia og slimproduksjon. TEER for prøver ble målt og resultatene lignet på målinger av primære epitelcellekontrollprøver for luftveier.
Etterfølgende fiksering med paraform aldehyd og immunolmerking for kanoniske luftveis epitelcellemarkører ble utført for MUC5AC og acetylert alfa-tubulin blant andre. Etter denne protokollen kan forskere generere et stort antall pasientavledede luftveis epitelceller for å vurdere ulike avlesninger, inkludert de som tester funksjonene til basale, sekretoriske og multiciliated celler i både sykdom og helse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
