Aversiv associativ inlärning och minnesbildning genom att para ihop två kemikalier i Caenorhabditis elegans

Inlärning och minne är avgörande för att djur ska överleva och reproducera sig genom att effektivt navigera i ständigt föränderliga miljöer. Det är också ett av de viktigaste ämnena som studeras inom neurovetenskap. Caenorhabditis elegans är en attraktiv organism för studier av lärande och minne på grund av nervsystemets enkelhet.

Dess kemiska och elektriska kopplingsscheman är också helt rekonstruerade. Caenorhabditis elegans beteendeanalys är extremt knepig och påverkas av ett antal parametrar som kemiska, mekaniska och temperaturpåfrestningar. För att börja, förbered sex centimeter nematodtillväxtmedium, eller NGM-plattor, genom att sprida 0,2 ml av en E.coli OP50 flytande kultur i ett Luria-Bertani-medium och inkubera dem vid rumstemperatur i högst 24 timmar.

På dag ett, plocka och placera fem välmatade gravida djur på varje sex centimeter NGM-tallrik med en platinamaskplockare och låt dem lägga cirka 50 ägg i tre timmar vid rumstemperatur för att få en synkroniserad population av vuxna djur. För att stoppa äggläggningen, ta bort föräldradjur från plattorna med en platinamaskplockare. Odla djuren vid rumstemperatur i cirka fem dagar för att nå det mogna vuxenstadiet, inte det unga vuxna stadiet.

Efter fem dagar, samla cirka 200 vuxna djur i en djuruppsamlare genom att tvätta varje tallrik med en milliliter 0,25% vattenhaltigt gelatin som förhindrar vidhäftning av djuren till ytan av plast, såsom pipettspetsar. Tvätta sedan djuren genom att försiktigt flytta uppsamlaren upp och ner två gånger i 10 ml dubbeldestillerat vatten. Upprepa processen två gånger.

Sänk försiktigt ner djuruppsamlaren som innehåller cirka 200 djur i 40 ml av en blandning av 1%1-propanol och saltsyra vid pH 4 i en kristalliserande skål i en sekund. Tvätta djuren i kollektorn genom att mycket försiktigt nedsänka kollektorn en gång i en brunn av dess 6-brunns vävnadsodlingsplatta innehållande 10 ml dubbeldestillerat vatten. Placera sedan kollektorn på en E.coli OP50-gräsmatta på en sex centimeter NGM-platta i 10 minuter så att djuren kan vila.

Tvätta sedan djuren i kollektorn med 10 ml dubbeldestillerat vatten genom att försiktigt flytta kollektorn upp och ner. Upprepa denna tvätt tre gånger och fortsätt till kemotaxisanalys. Tvätta djuren sekventiellt i en uppsamlare med propanolblandning och dubbeldestillerat vatten, en gång var och en som visats tidigare.

Placera sedan samlaren på en E.coli OP50 gräsmatta på en NGM-agar i en sex centimeter petriskål i 10 minuter för att djuren ska vila. Tvätta sedan djuren tre gånger genom att försiktigt flytta uppsamlaren upp och ner två gånger i 10 ml dubbeldestillerat vatten för att förhindra bakteriell kontaminering och fortsätt till kemotaxisanalys. Förbered skruvplattor för kemotaxisanalysen i sex centimeter plast petriskålar.

Använd sedan en sågad pipettspets med en öppning på mer än en millimeter för att överföra djuren från kollektorn till ett två milliliter mikrocentrifugrör innehållande en milliliter 0,25% vattenhaltigt gelatin. När djuren har bosatt sig i botten av röret genom tyngdkraften, ta bort supernatanten från röret. Återsuspendera djuren i en milliliter kemotaxianalysbuffert och låt dem slå sig ner genom tyngdkraften till botten av röret i cirka en minut.

Ta sedan bort så mycket supernatant som möjligt genom att pipettera. Därefter upptäcker du diagonalt fyra mikroliter 5% vattenhaltig 1-propanol på två ställen och upptäcker sedan fyra mikroliter dubbeldestillerat vatten på två andra ställen i Petri-plattan. Använd sedan en sågad pipettspets med en millimeters öppning för att upptäcka sex mikroliter av djursuspensionen i en kemotaxianalysbuffert som innehåller cirka 60 djur i mitten av tre plattor.

Ta bort vätskan så mycket som möjligt med en laboratorievävnadsveke utan att röra djuren. Placera ett lock på plattan och låt djuren röra sig fritt på plattan i 10 minuter vid rumstemperatur. För att stoppa kemotaxi, överför denna tallrik till en petriskål i glas på is i tre minuter.

Placera sedan plattan i kylskåp tills du räknar antalet djur på plattan. Räkna antalet djur i fyra sektioner förutom de i mittcirkeln under ett stereomikroskop och beräkna kemotaxiindexet med hjälp av ekvationen. Från kemotaxiindexvärdena beräknar du inlärningsindexvärdena som skillnaden mellan kemotaxiindexvärdet för referensdjuren och kemotaxiindexvärdet för de konditionerade djuren.

I kemotaxisanalysen lockades djur konditionerade med blandningen av 1-propanol och saltsyra vi inte till 5% 1-propanol fläckade på agarplattor, medan naiva och referensdjur lockades till 5% 1-propanol. Djur som konditionerades av den åtskilda träningen med en blandning av vattenhaltig 1-propanol och saltsyra lockades inte längre till 5% 1-propanol jämfört med djur som behandlades med 1% 1% 1-propanol eller saltsyra eller endast dubbeldestillerat vatten. Att studera effekten av mutationer på minnet avslöjade att kortvarig och långsiktig minnesbildning berodde på att generna spelade viktiga roller i den klassiska konditioneringen av djuren.

Efter varje konditionering ska djuren tvättas försiktigt endast en gång med dubbeldestillerat vatten. Efter att långtidsminnet har bildats med hjälp av proceduren kan kalciumavbildning och elektrofysiologi identifiera neuronala kretsar som är ansvariga för minnet. Genom genetiska och enskilda neuronanalyser kan minneslagrings- och hämtningsprocesserna hanteras på molekylär och encellsnivå.