Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Aversiv associativ inlärning och minnesbildning genom att para ihop två kemikalier i Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Vi har tidigare utvecklat protokoll för Caenorhabditis elegans för att bilda kort- och långsiktiga associativa minnen genom masserad respektive distansträning. Här beskrivs detaljerade protokoll för konditionering av C. elegans genom att para ihop 1-propanol och saltsyra som konditionerade respektive okonditionerade stimuli för att bilda aversivt associativt minne.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans är en attraktiv modellorganism för att studera inlärning och minne på molekylära och cellulära nivåer på grund av enkelheten i dess nervsystem, vars kemiska och elektriska kopplingsscheman rekonstruerades helt från seriella elektronmikrografer av tunna sektioner. Här beskriver vi detaljerade protokoll för konditionering av C. elegans genom mass- och distansträning för bildandet av korttidsminne (STM) respektive långtidsminne (LTM). Genom att para ihop 1-propanol och saltsyra som konditionerade respektive okonditionerade stimuli tränades C. elegans framgångsrikt för att bilda aversiv associativ STM och LTM. Medan naiva djur lockades till 1-propanol, var de utbildade djuren inte längre eller mycket svagt lockade till 1-propanol. Liksom i andra organismer som Aplysia och Drosophila spelar "inlärnings- och minnesgener" viktiga roller i minnesbildning. Särskilt krävs glutamatreceptorer av NMDA-typ, uttryckta i endast sex par interneuroner i C. elegans, för bildandet av både STM och LTM, möjligen som en slumpfaktor. Därför kan minnesspåret ligga bland interneuronerna.

Introduction

Inlärning och minne är avgörande för att djur ska överleva och reproducera sig genom att effektivt navigera i föränderliga miljöer. C. elegans är en attraktiv modellorganism för att studera inlärning och minne på molekylär och cellulär nivå på grund av enkelheten i dess nervsystem, vars kemiska och elektriska kopplingsscheman rekonstruerades helt från seriella elektronmikrografer av tunna sektioner 1,2,3.

C. elegans lär sig att associera odlingstemperatur med svält och migrerar bort från sin tillväxttemperatur med ett aversivt minne som varar i flera timmar 4,5. Konditionering av C. elegans med natriumklorid (NaCl) i frånvaro av mat leder till en minskning av kemotaxi mot NaCl 6,7,8. I kombination med mat förbättras butanonattraktionen som ett resultat av aptitligt lärande 9,10,11. Även om dessa fenomen tolkas som associativt lärande och minne 10,12, är skillnaden mellan associativt lärande och icke-associativ sensibilisering, tillvänjning och anpassning inte tydlig i C. elegans inlärnings- och minnesparadigm13,14. Faktum är att djur konditionerade med butanon och matbrist (aversiv konditionering) visade deprimerad koppling av butanon sensorisk neuron AWC ON för att rikta neuroner genom insulinsignaler från andra neuroner, inklusive AIA-interneuroner, medan djur konditionerade med butanon och mat (aptitlig konditionering) visade förbättrad koppling av AWCON till målneuroner15 . Insulinsignaleringen orsakar genuttrycksförändringar inducerade av nukleär EGL-4 och andra transkriptionella regulatorer16,17. Således har detta aversiva och aptitliga lärande och minne analogier med icke-associativ tillvänjning respektive sensibilisering av presynaptiska sensoriska neuroner i gillabstinensreflexen i Aplysia18,19.

Genom att para ihop två kemikalier som konditionerad stimulans (CS) och okonditionerad stimulans (USA) har vi och andra utvecklat protokoll för konditionering av C. elegans för att bilda associativt lärande och minne utan att använda mat eller svält som USA20,21,22,23. I den aktuella studien modifieras protokollen för att konditionera djur med 1-propanol och saltsyra (HCl, pH 4.0) som CS respektive USA för aversiv inlärning och korttidsminne (STM) och långtidsminne (LTM). Naiv C. elegans lockas av 1-propanol24 och avvisas av syra25. När den konditionerades med en blandning av 1-propanol och HCl (pH 4,0) var C. elegans inte längre eller mycket svagt attraherad av 1-propanol.

Protocol

1. Recept

  1. NGM-agarplattor (steg 2.1.)
    1. För att förbereda 6 cm NGM-plattor, lös upp 2,5 g pepton, 3 g NaCl och 17 g agar i 850 ml dubbelt avjoniseradH2O(ddH2O). Bringa den totala volymen till 972 ml med ddH2O.
    2. Efter autoklavering, svalna till ~ 65 ° C och tillsätt 1 ml 5 mg / ml kolesterol upplöst i etanol, 1 ml vardera av 1 M CaCl2 och 1 M MgSO4 och 25 ml 1 M kaliumfosfat (pH 6,0). Efter blandning väl, dispensera 8 ml vardera till 6 cm (i diameter) petriskålar.
    3. Förvara plattorna med lock på en bänk vid rumstemperatur (RT) i 1 dag och förvara dem sedan i plastvaror i ett kallt rum tills de används.
  2. Bered Luria-Bertani (LB) medium (steg 2.1.) genom att lösa upp 10 g trypton, 5 g jästextrakt och 10 g NaCl i 1 liter ddH2O. Justera pH-värdet till 7,0 med 5 N NaOH (flera droppar) och sterilisera genom autoklavering.
    1. Förbered LB-plattor genom att tillsätta 15 g agar till LB-medium. Efter autoklavering, svalna till ~ 60 ° C och dosera 12 ml vardera till 9 cm (i diameter) petriskålar. Förvara tallrikar i plastvaror i ett kallt rum tills de används.
  3. För att göra en djuruppsamlare (steg 2.4.), fäst nylonnät (30 μm maskstorlek) på botten av ett klart akrylcylindriskt rör (3,5 cm i längd, 3 cm i ytterdiameter, 2 mm i väggtjocklek) med lim.
  4. För att göra 0,25% vattenhaltig gelatinlösning (steg 2.4.), lös upp 0,25 g gelatin i 100 ml ddH2O. Sterilisera genom autoklavering.
  5. Kemotaxanalysplattor (steg 5.1.)
    1. För att göra agarplattor för kemotaxisanalys, lös upp 15 g agar i 993 ml ddH2O genom autoklavering och kyl ner lösningen till ~ 65 ° C.
    2. Tillsätt sedan 5 ml autoklaverat 1 M kaliumfosfat (pH 6,0), 1 ml 1 MCaCl2 och 1 ml 1 M MgSO4 till agarlösningen. Alla dessa lösningar steriliseras separat genom autoklavering.
    3. Dispensera 10 ml av den blandade lösningen till en 6 cm petriskål. Placera dessa plattor med lock på en bänk på RT i två dagar och lägg dem sedan på våta pappershanddukar i plastvaror vid RT tills de används. Dessa plattor kan användas i upp till 10 dagar.
  6. För att göra kemotaxisanalysbuffert (steg 5.4), blanda 5 ml 1 M kaliumfosfat (pH 6.0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 och 993 ml ddH2O. Sterilisera alla dessa lösningar separat genom autoklavering.
  7. För att göra en 40 ml CS/US-blandningslösning (1% vattenhaltig 1-propanol och HCl [pH 4.0]) (steg 3.1 och steg 4.1), tillsätt 0,4 ml absolut 1-propanol och 4 μl 5 M HCl (0,1 mM vid slutlig koncentration) till 39,6 mlddH2O. Håll lösningen vid RT.
  8. För att göra ddH2O, behandla kranvatten 2x med vattenreningssystem (se materialförteckning).
  9. Bered en flytande odling (OD600 = ~ 0,7) av Escherichia coli OP50 genom att ympa en färsk koloni med en tandpetare i 10 ml LB-medium och inkubera vid 37 °C i 7-8 timmar. Bakterier som odlas under en längre period kan påverka resultatet av konditionering, kanske på grund av sekundära metaboliter.

2. Förberedelse av synkroniserad C.  elegans

  1. Använd standardmetoder26 för att odla djur på 6 cm NGM-plattor (steg 1.1). NGM-plattor framställs genom att sprida 0,2 ml av en E. coli OP50 flytande kultur i LB-medium (se steg 1.9 .) och inkubera vid RT i högst 24 timmar (gamla bakterier kan påverka resultatet av konditionering).
    OBS: C. elegans inlärning och minne är extremt känsliga för mekaniska, kemiska och temperaturspänningar. Därför rekommenderas det starkt att odla djur, behålla alla reagenser inklusive vatten och utföra alla analyser vid RT mellan 17 °C och 20 °C. Fysisk och mekanisk stimulering som virvel, grovpipettering och centrifugering måste undvikas. Färsk 1-propanol ska användas var 3: e månad längst av okänd anledning. Viktigt är att djur måste odlas med mycket mat eftersom svält allvarligt kan påverka resultatet av konditionering.
  2. På dag 1, plocka och placera fem välmatade graviddjur (sätt fler mutanta djur som lägger ägg långsamt) på var och en av de fyra 6 cm NGM-plattorna med en platinamaskplockare och låt dem lägga ~ 50 ägg i 3 timmar vid RT för att få en synkroniserad population av vuxna djur. Stoppa äggläggningen genom att ta bort föräldradjur från plattorna med en platinamaskplockare.
    OBS: Fröade plattor bör förvaras vid RT för att minimera stress för djuren.
  3. Odla djuren vid RT i cirka 5 dagar, vilket är den tid det tar för djur att nå sitt mogna vuxna stadium, inte det unga vuxna stadiet.
    OBS: Odlingsperioden mellan 4,5 dagar och 5,5 dagar bör justeras beroende på förhållandena eftersom yngre vuxna djur är känsligare för de kemikalier som används för konditionering än mogna vuxna djur (kompletterande figur 1). Efter konditionering kan yngre vuxna djur visa lägre kemotaxiindex (CI).
  4. Samla ~200 vuxna djur i en djuruppsamlare (se steg 1.4.) genom att tvätta varje platta med 1 ml 0,25% vattenhaltigt gelatin (steg 1.4.) Detta vattenhaltiga gelatin förhindrar vidhäftning av djuren till ytan av plast, såsom pipettspetsar.
  5. Tvätta djuren i uppsamlaren med ddH 2 O(steg 1.8.) genom att mycket försiktigt flytta uppsamlaren upp och ner 2x i ~ 10 ml ddH 2 O. Upprepa denna process 2x mer (3x totalt) med ~ 10 ml ddH2O vardera för att förhindra bakteriell kontaminering.
    OBS: Bakteriell kontaminering påverkar allvarligt kemotaxi hos djur.

3. Massträning för kortvarigt associativt lärande och minne

Se bild 1 för det masserade träningsarbetsflödet.

  1. Sänk försiktigt ner djuruppsamlaren som innehåller ~ 200 djur i 40 ml av en blandning av 1% 1% 1-propanol och HCl (pH 4,0 efter blandning med 1-propanol; se steg 1.7.) i en kristalliserande skål i ~ 1 s.
    OBS: För kontrolldjuren, gör detsamma men doppa endast i 1% vattenhaltig 1-propanol. Det skulle vara bättre att behandla djur med HCl (pH 4,0) endast som en annan kontroll.
  2. Tvätta djuren i kollektorn genom att mycket försiktigt nedsänka kollektorn 1x i 10 ml ddH2O i en brunn av en 6-brunns vävnadsodlingsplatta.
    OBS: Detta tvättsteg måste vara mycket skonsamt och endast göras 1x eftersom omfattande tvätt kan förhindra inlärning.
  3. Upprepa steg 3.1. och 3.2. 10x utan avbrott (intervall mellan försök [ITI], 0 min).
    OBS: Använd färskt ddH2O varje gång vid RT.
  4. Placera kollektorn på en E. coli OP50 gräsmatta på en 6 cm NGM-platta i 10 min vid RT så att djuren kan vila.
  5. Tvätta djuren i kollektorn med ddH 2 Ogenom att mycket försiktigt flytta kollektorn upp och ner 2x i ~ 10 ml ddH 2 O. Upprepa denna process 2x mer (3x totalt) med ~ 10 ml ddH2O vardera för att förhindra bakteriell kontaminering.
  6. Fortsätt till kemotaxisanalys enligt beskrivningen nedan (steg 5).

4. Distansutbildning för långsiktigt associativt lärande och minne

Se bild 2 för träningsarbetsflöde med mellanrum.

  1. Sänk försiktigt ner en djuruppsamlare som innehåller ~ 200 djur i 40 ml av en blandning av 1% 1% 1-propanol och HCl (pH 4,0 efter blandning med 1-propanol; se steg 1.7.) i en kristalliserande skål i ~ 1,0 s.
    OBS: Gör samma sak med 1% vattenhaltig 1-propanol endast som en kontroll. Det skulle vara bättre att behandla djur med HCl (pH 4,0) endast som en annan kontroll.
  2. Tvätta djuren i kollektorn genom att mycket kort nedsänka kollektorn 1x i 10 ml ddH2O i en brunn av en 6-brunns vävnadsodlingsplatta.
    OBS: Denna tvätt måste vara mycket kort eftersom omfattande tvätt kan förhindra inlärning.
  3. Placera kollektorn på en E. coli OP50 gräsmatta på en NGM agarplatta i en 6 cm (i diameter) petriskål i 10 min vid RT så att djuren kan vila.
    OBS: Denna vila i 10 min eftersom ITI är avgörande för att djuren ska kunna konsolidera minnen för bildandet av LTM.
  4. Upprepa steg 4.1.-4.3. 10x.
  5. Tvätta djuren i kollektorn med ddH 2 O genom att mycket försiktigt flytta kollektorn upp och ner 2x i ~10 ml ddH 2 O, som hålls vid RT. Upprepa denna process 2x mer (3x totalt) med ~ 10 ml ddH2O vardera för att förhindra bakteriell kontaminering.
  6. Fortsätt till kemotaxisanalys enligt beskrivningen nedan (steg 5.).

5. Chemotaxis-analys

  1. Förbered agarplattor för kemotaxianalys i 6 cm plast petriskålar (se steg 1.5.).
  2. Överför djur i kollektorn (steg 2.5.), som placeras på en plan yta av ett petriskålslock av plast, till ett 2 ml mikrocentrifugrör med 1 ml 0,25% vattenhaltigt gelatin med en avsågad pipettspets med en öppning på >1 mm (innerdiameter).
    OBS: Det är viktigt att använda en sågad pipettspets för att minimera skjuvbelastningen på djur.
  3. Ta bort supernatanten från röret efter att djuren har satt sig i botten av röret genom tyngdkraften i ~ 1 min (centrifugera inte).
  4. Återsuspendera försiktigt djuren i 1 ml kemotaxianalysbuffert (se steg 1.6) och låt dem lägga sig ner genom tyngdkraften till rörets botten i ~ 1 min (centrifugera inte). Ta bort så mycket supernatant som möjligt genom pipettering.
  5. Under tiden kan du diagonalt upptäcka 4 μL vardera av 5% vattenhaltigt 1-propanol på två ställen och upptäcka 4 μL vardera av ddH2O på två andra platser på samma sätt, som visas i figur 3A. För kemotaxisanalys av mutanter som har lägre känslighet för 1-propanol, upptäck högre koncentrationer av vattenhaltig 1-propanol som resulterar i ~ 0.6 kemotaxiindex (CI) värden för naiva mutanter, som visas i kompletterande tabell 1.
    OBS: Det är viktigt att slutföra spottingprocedurerna så snabbt som möjligt. Spot 5% vattenhaltig 1-propanol eftersom 1% vattenhaltig 1-propanol är för svag för att locka djur i kemotaxisanalysen. Använd däremot 1% vattenhaltig 1-propanol för konditionering eftersom djur som behandlats med högre koncentrationer av vattenhaltig 1-propanol än 1% visar lägre CI-värden.
  6. Spot 6 μl delar av djursuspensionen i kemotaxianalysbuffert (steg 5.4.) innehållande ~60 djur i mitten av tre plattor för kemotaxianalys med hjälp av en avsågad pipettspets med en öppning på ~1,0 mm (innerdiameter). Ta bort vätska så mycket som möjligt med en laboratorievävnadsveke utan att röra djuren och lägg ett lock på plattan.
    OBS: Det är viktigt att slutföra dessa procedurer så snabbt som möjligt.
  7. Låt djuren röra sig fritt på tallriken i 10 minuter vid RT och överför sedan tallriken till en petriskål i glas på is i 3 minuter för att stoppa kemotaxi. Förvara sedan plattan i kylskåp tills du räknar antalet djur på tallriken.
  8. Räkna antalet djur i fyra sektioner, förutom de i mittcirkeln, under ett stereomikroskop och beräkna kemotaxiindexet (C.I.) med hjälp av ekvationen som visas i figur 3B. Från C.I.-värdena beräknar du inlärningsindexvärden (L.I.) som skillnaden mellan referensdjurens C.I.-värde och C.I.-värdet för de konditionerade djuren (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
    OBS: C.I.-värdet för referensdjuren (C.I.-referens) är medelvärdet av C.I.-värdena för djur som endast är konditionerade med 1% vattenhaltig 1-propanol.

Representative Results

C. elegans konditionerades av massträning för att bilda kortvarigt aversivt associativt minne genom att para ihop 1% vattenhaltig 1-propanol och HCl (pH 4.0) som CS respektive USA. Enligt protokollet som beskrivs ovan odlades synkroniserade djur på en bänk vid en RT på 18 °C i 5 dagar och tvättades mycket försiktigt 2x med ddH2O vid en RT på 18 °C. Därefter konditionerades djuren med en blandning av 1% vattenhaltig 1-propanol och HCl (pH 4,0) i 1 s. Vi tränade också djur med endastddH 2O, endast 1% vattenhaltig 1-propanol och HCl (pH 4.0) endast som referenser. Efter konditioneringen tvättades djuren 1x med ddH2O. Vi upprepade konditioneringen 10x utan avbrott (inga ITI). Framgångsrik konditionering uppnåddes genom att upprepa proceduren mer än 7x upp till 10x. Konditionering mer än 10x resulterade i mindre effektiv inlärning21. Efter träningen vilade djuren på bakteriefoder i 10 min vid RT (18 °C). Efter att ha tvättats medddH2O3xöverfördes djuren till ett mikrocentrifugrör genom att suspendera i 0,25% vattenhaltigt gelatin och sedimenteras till botten genom tyngdkraften. Efter att ha tagit bort supernatanten så mycket som möjligt återsuspenderades djuren försiktigt i kemotaxisanalysbuffert och fick sedan slå sig ner till botten av röret genom tyngdkraften.

Efter att ha avlägsnat så mycket supernatant som möjligt upptäcktes djursuspensionen i mittcirkeln på en kemotaxianalysplatta, som hölls vid en RT på 18 °C, och sedan fick djuren röra sig fritt på plattan i 10 minuter vid en RT på 18 °C. C.I.-värden beräknades med hjälp av ekvationen som visas i figur 3B. Som visas i figur 4A lockades djur konditionerade med blandningen av 1% 1-propanol och HCl inte längre till 5% 1-propanol som upptäcktes på agarplattor för kemotaxisanalys, medan naiva och referensdjur på samma sätt lockades till 5% 1-propanol. Efter massträningen (steg 3.) observerades minnet inte längre inom 3 h20. Dessutom var minnet som bildades av massträningen känsligt för köldchock20. Dessa resultat visar att C. elegans framgångsrikt bildade aversiv STM genom massträning.

Djuren konditionerades också av distansträning 10x med en 10 min ITI mellan träningsstegen (steg 4.). Under ITI placerades uppsamlaren med djur på en bakteriegräsmatta på en 6 cm NGM-platta vid en RT på 18 °C. Djur som konditionerades av den åtskilda träningen med en blandning av 1% vattenhaltig 1-propanol och HCl (pH 4,0) lockades inte längre till 5% 1-propanol jämfört med djur som behandlades med endast 1% 1-propanol, endast HCl (pH 4.0) eller endast ddH2O (figur 4B). Efter den åtskilda träningen behöll djuren minnet i mer än 12 timmar20,21. Dessutom bildades inte minnet när djur behandlades med översättnings- eller transkriptionshämmare och var resistenta mot kallchock20,21. Därför bildade C. elegans framgångsrikt aversiv LTM genom distansutbildning.

Vi undersökte också effekterna av mutationer i "inlärnings- och minnesgener" på bildandet av STM och LTM. Crh-1-genen kodar för den allestädes närvarande transkriptionsfaktorn cAMP-response element-binding protein (CREB), glr-1 och nmr-1 kodar för α-amino-3-hydroxyl-5-metyl-4-isoxazolepropionsyra (AMPA)-typ respektive N-metyl-D-aspartat (NMDA)-typ glutamatreceptorunderenheter och stau-1 kodar för det dubbelsträngade RNA-bindande proteinet Staufen-isoform. Dessa gener spelar viktiga roller i klassisk konditionering i C. elegans, Drosophila, Aplysia och möss. Med hjälp av en blandning av 1% vattenhaltig 1-propanol och HCl (pH 4.0) var bildandet av STM och LTM beroende av alla gener (figur 5A,B).

Figure 1
Figur 1: Experimentell schematisk för masserad träning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Experimentell schematisk för distansutbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kemotaxanalys och kemotaxiindex . (A) Schematisk representation av en kemotaxianalysplatta. Petriskålar (6 cm i diameter) separerades i fyra områden som visas, och 4 μL vardera av 5% vattenhaltig 1-propanol eller ddH 2 O upptäcktes diagonalt på två ställen vardera,2cm från mitten. (B) Kemotaxindexvärden beräknades utifrån ekvationen som visades genom att räkna antalet djur i områdena "a" och "b" efter avslutad kemotaxi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Kemotaxindexvärden för djur konditionerade med kemikalier. Synkroniserade N2-djur av vild typ konditionerades med kemikalier som indikerades av (A) massträning 10x eller (B) distansträning 10x. Flödesscheman över de masserade och åtskilda träningsprotokoll som används visas i figur 1 respektive figur 2. Efter konditioneringen var djuren fria att röra sig i 10 minuter på en 6 cm agarplatta för kemotaxianalys vid en RT på 18 °C. C.I.-värden beräknades med hjälp av ekvationen som visas i figur 3B. Uppgifter för denna siffra finns i kompletterande tabell 1. Data från de naiva djuren ritades om i båda figurpanelerna. Stapeldiagram visar 1:a kvartilen, medianen och 3:e kvartilen. Asterisker (*P < 0,05) indikerar statistiskt signifikanta skillnader som bestäms av enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Inlärningsindexvärden för konditionerade mutanta djur. Synkroniserade vildtyp N2 och mutanta djur som indikerades konditionerades med en blandning av 1% vattenhaltig 1-propanol och HCl (pH 4.0) genom (A) massträning 10x eller (B) distanserad träning 10x. Flödesscheman över de masserade och åtskilda träningsprotokoll som används visas i figur 1 respektive figur 2. Efter konditioneringen var djuren fria att röra sig i 10 minuter på en 6 cm agarplatta för kemotaxianalys vid en RT på 18 °C. Uppgifter för denna siffra finns i kompletterande tabell 2. Stapeldiagram visar 1:a kvartilen, medianen och 3:e kvartilen. Asterisker (*P < 0,05) indikerar statistiskt signifikanta skillnader som bestäms av enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Unga vuxna djur är känsliga för kemisk behandling. Dag 4 och dag 5 vildtyp N2-djur efter kläckning masstränades 10x med HCl, pH 4,0, utan avbrott och analyserades sedan för kemotaxi till 5% vattenhaltig 1-propanol. Staplar betyder ± S.E.M. (n = 19). Asterisker (*P < 0,05) indikerar statistiskt signifikanta skillnader som bestäms av tvåvägs ANOVA följt av Tukey-Kramer post-hoc-test. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Uppgifter som motsvarar figur 4. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 2: Uppgifter som motsvarar figur 5. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

I den aktuella studien hölls alla reagenser vid en RT på ~ 18 ° C i genomsnitt, och djur odlades på en bänk vid RT för att undvika stress för djuren. Dessutom utfördes alla försöksförfaranden vid RT. Djuren odlades först i en inkubator vid 20 °C och konditionerades sedan i en bänk vid ~24 °C med reagenser vid RT. Under dessa förhållanden var resultaten av konditioneringen mycket varierande. Vid låg RT växer C. elegans långsamt och bör odlas längre än vid 20 °C tills djuren når det mogna vuxenlivet, eftersom yngre vuxna djur är känsligare för de kemikalier som används för konditionering än mogna vuxna djur och kan visa lägre CI-värden.

Det mest kritiska steget för framgångsrik konditionering är tvättning av djur med ddH2O omedelbart efter varje kemisk behandling. Därför bör mekaniska påfrestningar och temperaturspänningar minimeras genom att använda sågade pipettspetsar, hålla reagenser vid RT och mycket försiktigt tvätta djuren genom att mycket långsamt flytta djuruppsamlaren upp och ner i ddH2O. Noggrann tvättning av djuren varje gång efter konditionering kan påverka inlärning och minne. Villkoren för kemotaxisanalysplattorna påverkar också resultaten allvarligt. För torra eller för våta plattor förhindrar jämn rörelse hos djuren. Plattorna bereddes enligt beskrivningen i steg 1. en bra platta är en för vilken de 4 μL-fläckarna av ddH2O eller 5% vattenhaltig 1-propanol absorberas fullständigt av agar på cirka 5 minuter efter spotting. Som beskrivits ovan är djuråldrar också avgörande för framgångsrik konditionering. Unga vuxna djur är känsliga för mekanisk och kemisk behandling, vilket resulterar i varierande resultat, även om mycket åldrade djur kanske inte heller är lämpliga för konditionering.

Hållbarheten för 1-propanol beror på märken och partier och är mindre än 3 månader vid RT. När CI-värdena hos naiva djur blir sämre, rekommenderas att använda färsk 1-propanol för konditionering och kemotaxianalys.

Minnesbildningen genom massträning påverkades inte av behandling av djur med translationshämmare (cykloheximid och anisomycin) och en transkriptionshämmare (aktinomycin D), medan minnesbildningen genom den åtskilda träningen hämmades markant av hämmarna20,21. Dessutom förföll det förra minnet av kallchock, medan det senare behölls under en längre period än det förra och var motståndskraftigt mot kallchock. Dessa resultat visar att den förra är STM och den senare är LTM respektive20,21. Minnet som bildas av massträningen kan dock bestå av STM och medeltidsminne (mellanperiodiskt) eftersom STM är svagt beroende av CREB-transkriptionsfaktorn (figur 5A). Detta överensstämmer med resultatet att STM behölls i mer än 1 h20,21. Bildandet av både STM och LTM är starkt beroende av nmr-1, vilket endast uttrycks i sex par neuroner (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG och PVC) i C. elegans27,28. I dessa neuroner kan därför NMDA-receptorer fungera som en molekylär slumpdetektor av 1% vattenhaltiga 1-propanol- och HCl (pH 4.0) -signaler för synaptisk plasticitet, där den synaptiska förstärkningen som krävs för både STM och LTM kan bero på tillfällig avfyrning av pre- och postsynaptiska neuroner 29,30,31,32,33. Därför kan det aversiva associativa minnet bildas bland interneuronerna.

De metoder som beskrivs i denna studie bör vara tillämpliga för aptitlig luktinlärning och kortvarigt och långsiktigt associativt minne med 1-nonanol som CS och kaliumklorid som US21. Det är intressant att jämföra de neuronala kretsarna som är involverade i bildandet av aptitliga och aversiva minnen.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang och Hitomi Ohtaki för deras tekniska hjälp och kommentarer till manuskriptet. Stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Detta arbete stöddes av finansiering från Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Tags

Neurovetenskap utgåva 184
Aversiv associativ inlärning och minnesbildning genom att para ihop två kemikalier i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter