Aversief associatief leren en geheugenvorming door twee chemicaliën te koppelen bij Caenorhabditis elegans

Leren en geheugen zijn van vitaal belang voor dieren om te overleven en zich voort te planten door efficiënt te navigeren door steeds veranderende omgevingen. Het is ook een van de belangrijkste onderwerpen bestudeerd in de neurowetenschappen. Caenorhabditis elegans is een aantrekkelijk organisme voor de studie van leren en geheugen vanwege de eenvoud van het zenuwstelsel.

De chemische en elektrische bedradingsschema’s zijn ook volledig gereconstrueerd. Caenorhabditis elegans’gedragsanalyse is uiterst lastig en wordt beïnvloed door een aantal parameters zoals chemische, mechanische en temperatuurspanningen. Bereid om te beginnen zes centimeter nematodengroeimedium of NGM-platen door 0,2 milliliter van een E.coli OP50 vloeibare cultuur in een Luria-Bertani-medium te verspreiden en ze niet langer dan 24 uur bij kamertemperatuur te broeden.

Pluk en plaats op dag één vijf goed gevoede gravid dieren op elke zes centimeter NGM-plaat met een platinawormplukker en laat ze ongeveer 50 eieren leggen gedurende drie uur bij kamertemperatuur om een gesynchroniseerde populatie volwassen dieren te verkrijgen. Om het leggen van eieren te stoppen, verwijdert u ouderdieren van de platen met een platina wormenplukker. Cultiveer de dieren ongeveer vijf dagen bij kamertemperatuur om het volwassen stadium te bereiken, niet het jongvolwassen stadium.

Verzamel na vijf dagen ongeveer 200 volwassen dieren in een dierenverzamelaar door elke plaat te wassen met een milliliter van 0,25% waterige gelatine die de hechting van de dieren aan het oppervlak van kunststoffen, zoals pipetpunten, voorkomt. Was vervolgens de dieren door de collector twee keer voorzichtig op en neer te bewegen in 10 milliliter dubbel gedestilleerd water. Herhaal het proces twee keer.

Dompel de dierenverzamelaar met ongeveer 200 dieren voorzichtig onder in 40 milliliter van een mengsel van 1%1-propanol en zoutzuur bij pH 4 in een kristalliserende schaal gedurende één seconde. Was de dieren in de collector door de collector een keer heel voorzichtig onder te dompelen in een putje van zijn 6-well weefselkweekplaat met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water. Plaats de collector vervolgens op een E.coli OP50 gazon op een zes centimeter NGM-plaat gedurende 10 minuten zodat de dieren kunnen rusten.

Was vervolgens de dieren in de collector met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water door de collector voorzichtig op en neer te bewegen. Herhaal deze was driemaal en ga verder met de chemotaxistest. Was de dieren achtereenvolgens in een collector met propanolmengsel en dubbel gedestilleerd water, eenmaal elk zoals eerder aangetoond.

Plaats de collector vervolgens op een E.coli OP50 gazon op een NGM agar in een petrischaaltje van zes centimeter gedurende 10 minuten zodat de dieren kunnen rusten. Was vervolgens de dieren driemaal door de collector twee keer voorzichtig op en neer te bewegen in 10 milliliter dubbel gedestilleerd water om bacteriële besmetting te voorkomen en ga verder met chemotaxis-assay. Maak vijzelplaten voor de chemotaxistest klaar in plastic petrischalen van zes centimeter.

Gebruik vervolgens een afgezaagde pipetpunt met een opening van meer dan een millimeter om de dieren van de collector over te brengen naar een microcentrifugebuis van twee milliliter met één milliliter van 0,25% waterige gelatine. Nadat de dieren zich door de zwaartekracht op de bodem van de buis hebben gevestigd, verwijdert u het supernatant uit de buis. Resuspenseer de dieren in één milliliter chemotaxis-testbuffer en laat ze ongeveer een minuut door de zwaartekracht op de bodem van de buis zakken.

Verwijder vervolgens zoveel mogelijk supernatant door te pipetteren. Zoek vervolgens diagonaal vier microliter van 5% waterig 1-propanol op twee plaatsen en spot vervolgens vier microliter dubbel gedestilleerd water op twee andere plaatsen in de petriplaat. Gebruik vervolgens een afgezaagde pipetpunt met een opening van één millimeter om zes microliter van de dierlijke suspensie te spotten in een chemotaxis-testbuffer met ongeveer 60 dieren in het midden van drie platen.

Verwijder de vloeistof zoveel mogelijk met een laboratoriumweefsel lont zonder de dieren aan te raken. Plaats een deksel op de plaat en laat de dieren 10 minuten vrij op de plaat bewegen bij kamertemperatuur. Om de chemotaxis te stoppen, breng deze plaat gedurende drie minuten over in een glazen petrischaal op ijs.

Plaats vervolgens het bord in een koelkast totdat u het aantal dieren op het bord telt. Tel het aantal dieren in vier secties, behalve die in de middelste cirkel onder een stereomicroscoop en bereken de chemotaxis-index met behulp van de vergelijking. Bereken op basis van de chemotaxis-indexwaarden de leerindexwaarden als het verschil tussen de chemotaxis-indexwaarde van de referentiedieren en de chemotaxis-indexwaarde van de geconditioneerde dieren.

In de chemotaxis-test, dieren geconditioneerd met het mengsel van 1-propanol en zoutzuur, worden we niet aangetrokken door 5% 1-propanol gespot op agarplaten, terwijl naïeve en referentiedieren werden aangetrokken door 5% 1-propanol. Dieren die door de afstandstraining werden geconditioneerd met een mengsel van waterig 1-propanol en zoutzuur werden niet langer aangetrokken tot 5% 1-propanol in vergelijking met dieren die werden behandeld met 1% 1-propanol of zoutzuur, of alleen dubbel gedestilleerd water. Het bestuderen van het effect van mutaties op het geheugen onthulde dat de vorming van kortetermijn- en langetermijngeheugens afhankelijk was van de genen die een essentiële rol speelden in de klassieke conditionering van de dieren.

Na elke conditionering mogen dieren slechts één keer voorzichtig worden gewassen met dubbel gedestilleerd water. Nadat het langetermijngeheugen is gevormd met behulp van de procedure, kunnen calciumbeeldvorming en elektrofysiologie neuronale circuits identificeren die verantwoordelijk zijn voor het geheugen. Door middel van genetische en enkelvoudige neuronanalyses kunnen de geheugenopslag- en ophaalprocessen worden aangepakt op moleculair en enkelcellig niveau.