Medicine
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微电极阵列和膜片钳记录在人诱导多能干细胞来源心肌细胞上的技术应用
Chapters
Summary August 4th, 2022
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人诱导的多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为药物诱导的心脏毒性筛查和疾病建模的有前途的 体外 模型。在这里，我们详细介绍了用于测量hiPSC-CMs的收缩力和电生理学的方案。
Transcript
心脏安全性评估是药物开发过程中的关键组成部分。人iPSC来源的心肌细胞已被证明是一种可靠、高效和基于人类的临床前心脏安全性评估模型。我们已经建立了全面研究人iPSC来源心肌细胞功能特征的方法，这些方法具有非常重要的疾病建模，药物诱导的心脏毒性筛查和精准医学。
越来越多地将人iPSC来源的心肌细胞纳入标准的临床前安全性评估过程，有可能提高候选化合物毒性预测的准确性。首先培养人iPSC来源的心肌细胞至少10天，然后再进行测量。打开温度控制器并将其设置为 37 摄氏度。
打开显微镜、相机和二氧化碳供应。用适量的无菌去离子水填充板架的水套。将96孔板放在板架上，并将细胞孵育至少五分钟。
打开视图软件，然后将相机帧速率设置为 75 帧/秒，并将视频或图像分辨率设置为 1024 x 1024 像素。应用自动对焦和自动亮度功能，记录人iPSC来源心肌细胞的视频和图像。小心地将8微升的额外细胞基质涂层溶液滴放在48孔微电极阵列板的每个孔的记录电极区域上。
然后在孔周围区域加入三毫升无菌去离子水，以防止涂层溶液蒸发。使用200微升移液器吸头，在同一行或同一列内从孔表面去除大部分额外的细胞基质培养基，而不接触电极。在记录电极区域上方的8微升接种培养基液滴中每孔接种50，000个细胞。
重复直到所有孔都接种了细胞。然后将微电极阵列板在加湿的细胞培养箱中孵育。向微电极阵列板的每个孔中缓慢加入150微升种子培养基。
在电镀后第10天，在显微镜下检查自发跳动的人iPSC CM单层的密度。将48孔微电极阵列板放入记录仪器中。确保温度为37摄氏度，二氧化碳为5%打开导航器软件。
在实验设置窗口中，选择心脏实时配置和场电位记录。应用自发或糊状跳动配置。在拍频检测参数中，将检测阈值设置为 300 微伏，最小跳动周期为 250 毫秒，最大跳动周期为 5 秒。
选择多项式回归进行场势持续时间计算。检查基线电活动信号是否成熟稳定，获取基线心脏活动1-3分钟。电镀后10天进行记录。
用tyrode溶液替换人iPSC CM维持培养基，并让细胞适应15分钟。将温度传感器插入腔室，然后将 35 毫米的培养皿放入其中。将温度调节到37摄氏度。
使用微量移液器拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出微量移液器。用细胞内溶液填充微量移液器，并将它们插入连接到膜片钳放大器头部级的支架中。打开采集软件，加载动作电位记录协议，选择电压钳位配置。
将微量移液器插入浴液中，并选择合适的单个人iPSC CM。 使用显微操纵器调整并降低微量移液器在所选细胞旁边的位置。当移液器吸头插入浴液中时，在示波器监视器上检查移液器电阻。
将移液器靠近细胞放置，电流脉冲将略微减小，以反映增加的密封电阻。用负压轻轻抽吸以增加阻力。这将形成一个千兆印章。
然后应用密封功能。施加额外的吸力以破坏膜以获得整个细胞记录配置。此时，使用放大器对话框从电压箝位模式切换到电流箝位模式，或者不注入电流。
按记录按钮生成并保存动作电位记录文件。在电镀后至少10天进行钙瞬时测量。准备新鲜的泰罗德溶液和Fura-2 AM装载溶液。
吸出人iPSC CM维持培养基，并用tyrode溶液清洗腔室两次。应用100微升Fura-2AM负载溶液，并在室温下孵育10分钟。用tyrode溶液替换Fura-2 AM上样溶液，并孵育至少五分钟以使Fura-2 AM完全脱酯。在倒置落射荧光显微镜的40倍油浸物镜上加入一滴浸油。
将细胞室放在显微镜的载物台适配器中。将温度控制器电线安装到浴室室，并将其设置为37摄氏度。安装电场刺激电极，并将脉冲设置为 0.5 赫兹，持续时间为 20 毫秒。
开启超高速波长切换光源，设置为340纳米和380纳米快速切换模式。对两个波长应用20毫秒的曝光时间，并应用20秒的记录时间。录制反映钙瞬态实时变化的视频，将数据导出到电子表格进行分析。
人iPSC来源的心肌细胞单层用于收缩运动测量。使用分析仪软件分析收缩松弛运动的轨迹，检测到收缩开始、收缩峰值、收缩结束、松弛峰值和松弛结束。在微电极阵列板内的所有电极上观察到人iPSC来源的心肌细胞单层的完全覆盖。
每个电极记录的成熟波形反映了具有可识别特征的心野电位。经过分析，得到了跳频周期、场电位持续时间和尖峰幅度。电流钳模式下的全细胞膜片钳记录记录单个心肌细胞的自发动作电位。
经过分析，得到了振幅、最大舒张电位和动作电位持续时间等多个参数。经过钙成像分析，得到F340随时间推移的F380比值，并绘制了受刺激钙瞬变的原始痕迹。此外，还获得了振幅、舒张期钙和钙衰变tau等参数。
重要的是使用处于良好跳动条件下的人iPSC来源的心肌细胞，以及确保人iPSC来源的心肌细胞的高纯度。该协议包括四种特定技术，用于研究人类iPSC衍生的心肌细胞功能，其他配置或自动是否研究在心脏中起关键作用的心脏离子电流
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