Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Plastoglobule lipiddråpeisolasjon fra plantebladvev og cyanobakterier
Chapters
Summary October 6th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En rask og effektiv protokoll presenteres for isolering av plastoglobule lipiddråper assosiert med ulike fotosyntetiske organismer. Vellykket fremstilling av isolerte plastoglobuler er et avgjørende første skritt som går foran detaljerte molekylære undersøkelser som proteomiske og lipidomiske analyser.
Transcript
Isoleringen av svært rene plastoglobuler er avgjørende for studien. En rask og effektiv protokoll for deres isolasjon som letter deres nedstrøms biokjemiske undersøkelse presenteres her. Den primære fordelen med denne metoden er den relative prosedyrens hastighet og dens tilpasningsevne til mange plantearter og miljøforhold.
Spesiell forsiktighet må utvises ved sonikering av thylakoidresuspensjoner for å sikre tilstrekkelig kraft til å stripe plastoglobuler fra thylakoider og med etterfølgende ekstraksjon av plastoglobuler fra sukrosegradient. Demonstrere denne prosedyren vil være Dr.Elsinraju Devadasu, en postdoktor forsker i laboratoriet mitt, og Febri Susanto, en doktorgradsstudent i laboratoriet mitt. Begynn med å anskaffe tre uker gamle frøplanter av seks sunne mais, som har V5-vekststadium og veier ca. 120 gram.
Klipp av alle bladene ved bunnen av stilken og dunk dem raskt i et isbad før du transporterer dem til kjølerommet. Arbeid under en grønn sikkerhetslampe, fjern maisbladene fra isbadet og klipp dem i mindre fem ganger fem centimeter biter ved hjelp av saks. Slip forsiktig og grundig halvparten av det klippede bladvevet i 350 ml av slipebufferen på et nivå lavere enn syv på en kommersiell blender.
Start og stopp blenderen fem til seks ganger for å sikre at alle bladene er kuttet. Filtrer homogenatet gjennom ett lag med 25 mikron nylonduk på en stor trakt til fire 250 milliliter sentrifugeflasker. Etter å ha gjentatt blandingstrinnet med det gjenværende klippede bladvevet, del filtratet jevnt mellom de fire flaskene.
Fjern en alikot av bladfiltratet og sett det til side for å bli lagret som en representativ total bladprøve. Deretter sentrifugerer filtratet i seks minutter ved 1.840 G og fire grader Celsius. Hell av den resulterende supernatanten, og med forsiktige virvlende bevegelser av børsten, resuspender pelleten i 12 ml medium R 0,2, inneholdende 0,2 molar sukrose.
Etter at pelleten er resuspendert i én flaske, tilsett suspensjonen i neste flaske og gjenta suspensjonen for å samle suspensjonene i én flaske. Fordel den samlede suspensjonen mellom seks tre milliliter ultrasentrifugerør, og når et maksimalt volum på 2,5 milliliter i hvert rør. Bruk deretter spisssonikatoren med en amplitude på 100% for å sonikere hvert rør fire ganger i 10 sekunder hver.
Sørg for å holde sonikatorhornet nedsenket og vekk fra væskeoverflaten for å forhindre skumming. Beveg sonikatorhornet sakte opp og ned i suspensjonen under hver runde. Mens vekslende de fire rørene, returner hvert rør til en isbøtte etter hver sonikering for å la prøven avkjøles.
Når det er gjort, sentrifuge den sonikerte rå-thylakoid-suspensjonen ved 150 000 G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Skum puteoverflaten ved hjelp av en sprøyte og 22 gauge nål og høst den resulterende gule og oljete flytende puten av rå plastoglobuler fra sukroseputen. Gjenopprett ca 500 mikroliter fra hvert rør og sett dem inn i et 2,0 milliliter rør.
Samle rå thylakoid alikoter før og etter sonikering og frigjøring av plastoglobuler. Når du er ferdig, kan du enten fortsette behandlingen av plantevev eller lagre de rå plastoglobulene ved minus 80 grader Celsius og rense dem senere. Dyrk 50 ml synechocystis-arter PCC 6802-kultur i BG11-medier i 7 til 10 dager for å nå den stasjonære fasen.
Bruk et spektrofotometer til å justere celletettheten til en optisk tetthet på 2,0 ved 750 nanometer. For å fjerne polysakkaridene, sentrifuge 50 ml kultur og fjern supernatanten. Gjenta vasking av cellene i 50 ml buffer A to ganger.
Suspender den vasket pelleten i 25 ml buffer A og bryt cellene ved hjelp av en fransk trykkcelle på 1, 100 pund kvadrattommer. Gjenta prosessen tre ganger under kalde forhold til lysfargen endres fra grønt til rødt, blått, grønt under hvitt lys. Fjern alikoten av cellehomogenatet og sett det til side for å bli lagret som en representativ total celleprøve.
Fordel det resulterende homogenatet i åtte tre-milliliter ultrasentrifugerør fylt til maksimalt 2,5 milliliter i hvert rør. Overlegg dette homogenatet med 400 mikroliter medium R, og produserer en trinngradient. Balanser rørene forsiktig ved å tilsette ekstra medium R etter behov før du sentrifugerer rørene.
Thylakoid og andre tyngre organeller, inkludert eventuelle polyhydroksyalkanoatlegemer, viser pelletsdannelse, mens plastoglobuler danner en gul oljeaktig pute på eller nær toppen av sukrosegradienten. Høst den resulterende flytende puten av rå plastoglobuler med en sprøyte, som vist tidligere, og deponer høsten i et to-milliliter rør. Skrap plastoglobuler av siden av ultrasentrifugerørveggen med en nålespiss om nødvendig.
Enten fortsette med cyanobakterier behandling eller lagre rå plastoglobules ved minus 80 grader Celsius og rense senere. For å høste de rene plastoglobulene ved hjelp av plantevevsbehandlingsmetoden, fremstill sukrosegradienten beskrevet tidligere ved bruk av 500 mikroliter rå plastoglobuler, 400 mikroliter medium R 0,2 og 400 mikroliter medium R.Etter sentrifugering, høst den resulterende flytende puten av rene plastoglobuler i et to-milliliter rør. Etter aliquoting de rene plastoglobulene og flashfrysing av alikotene i flytende nitrogen, må du enten lagre dem ved minus 80 grader Celsius eller lyofilisere dem til et tørt pulver.
For å høste rene plastoglobuler fra cyanobakterier, opprett en sukrosegradient, som nevnt tidligere, ved bruk av 500 mikroliter av de rå plastoglobulene, 750 mikroliter medium R 0,7 og 750 mikroliter medium R 0,2. Etter sentrifugering samles de rene plastoglobulene i et 1,5 milliliter rør og alikot de rene plastoglobulene. Når du er ferdig, blits fryse de rene plastoglobules alikotene i flytende nitrogen og lagre dem direkte ved minus 80 grader Celsius eller lyofilisere til et tørt pulver.
I denne metoden ble en betydelig mengde plastoglobule eller lipiddråpemateriale sett flytende på det øverste laget av sukroseputen. Etter etterfølgende sentrifugering ble rensede plastoglobuler oppnådd ved eller nær overflaten av sukrosegradienten. Etter vellykket isolering av plastoglobuler viste immunblotter utviklet for renhetsvurdering med antistoffer forhøyet mot arabidopsis thalianafibrillin 1a og arabidopsis thaliana photosystem II subenhet D1 at fibrillinhomologene primært var assosiert med thylakoider enn plastoglobulene.
For å sikre effektiv og konsentrert ekstraksjon av den flytende puten, plasser sprøytenålens åpning like under bufferens væskeoverflate mens den er helt nedsenket, og trekk deretter forsiktig opp. Isolerte plastoglobuleprøver er mottagelige for påfølgende proteomiske eller lipidomiske studier og har blitt brukt til å demonstrere endringene i den målrettede protein-lipidsammensetningen under forskjellige miljøforhold. Denne teknikken har muliggjort nye studier av plastoglobule, inkludert oppdagelsen av assosiert proteinkinaseaktivitet og tilstedeværelsen av oligomere proteinkomplekser gjennom etterfølgende biokjemisk undersøkelse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
