This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyse af mitokondriemorfologi gennem simuleringsovervåget læring
Chapters
Summary March 3rd, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikel forklarer, hvordan man bruger simulationsovervåget maskinlæring til analyse af mitokondriermorfologi i fluorescensmikroskopibilleder af faste celler.
Transcript
Vi demonstrerer brugen af et simuleringsovervåget maskinlæringsværktøj til analyse af mitokondrier i fluorescerende mikroskopibilleder af faste celler. Nuværende metoder til at segmentere mitokondrier i mikroskopibilleder inkluderer automatiske tærskelbaserede metoder såsom Ostu eller manuel segmentering. Tærskelbaserede teknikker fungerer dårligt, hvor signal/baggrundsforholdet er lavt.
Typisk har billeder til den morfologiske analyse et stort antal mitokondrier, hvilket gør manuel segmentering kedelig. Overvågede deep learning-metoder udfører segmentering med høj nøjagtighed, men kræver et stort antal input-jord-sandhedspar-data til træning. Denne tilgang bruger en fysikbaseret simulator til at generere par mikroskopibilleder og deres 2D-jord-sandhedsformmaske, hvilket eliminerer behovet for manuel annotering.
Modellen, der er trænet på simulerede billeder, bruges derefter til at segmentere mitokondrier i ægte mikroskopbilleder. Vi bruger et deep learning-baseret segmenteringsværktøj, der muliggør automatisering af denne opgave med høj nøjagtighed, og som ikke kræver et kommenteret ground-truth-datasæt til træning. Simuleringen starter med geometrigenereringen ved hjælp af parametriske kurver til formgenerering.
Emittere er ensartet fordelt og tilfældigt placeret på overfladen af den genererede form, således at densiteten matcher eksperimentelle værdier. En 3D PSF af mikroskopet beregnes ved hjælp af Gibson-Lanni-modellen. For at opnå fotorealisme mellem de simulerede billeder og de eksperimentelle billeder efterligner vi både mørke og skudlyde.
Den fysiske grundsandhed genereres i form af et binært kort. Vi vurderer effekten af CCCP-behandling på mitokondriermorfologi af faste kardiommyoblaster afbildet ved hjælp af et konfokalmikroskop. Cellekultur.
Forbered dig på såning af cellerne, der fungerer i en steril laminær strømningshætte, ved at placere en dækslip for hver eksperimentel tilstand i en brønd med en 12-brøndplade. Sørg for, at den fortyndede cellesuspension blandes korrekt ved at pipettere indholdet af centrifugerøret op og ned flere gange, før det passende volumen dispenseres til hvert hul. Eksperimentel procedure.
Aspiratcellekulturmedier fra brøndene i 12-brøndpladen påfør derefter hurtigt friske forvarmede medier på kontrolbrøndene og det forvarmede medie med 10 mikromolære CCCP-opløsninger på testtilstandsbrøndene. Inkubere i 37 Celsius celleinkubatoren i to timer. Aspirer cellekulturmedier fra brøndene og påfør den forvarmede fikseringsopløsning.
Farvning og montering af celler på dækglider. Tilsæt 10 mikroliter monteringsmedier til et forberedt glasglas for at montere en dækslip. Tag dæksedlen op fra 12-brøndpladen ved hjælp af en pincet, og dup fugt af dækslyngerne ved kortvarigt at røre ved kanten og bagsiden af dækslet glide til det forberedte fnugfri papirhåndklæde.
Sænk forsigtigt dækslet ned på den ventende dråbe af monteringsmedier. Mikroskop og billeddannelse. Brug okularerne til manuelt at justere Z-niveauet for at have prøven i fokus.
Skift til den erhvervede fane i software. Brug den smarte opsætning til at vælge fluorescenskanal, der skal bruges til billeddannelse. Opstillingscentreret på midten af dækslippet med i alt 12 positioner, der skal afbildes.
Placer RA centreret på midten af dækslip. Det er muligt at afbilde flere steder på en automatiseret måde. Generering af simulerede træningsdata.
Download koden, og pak indholdet ud. Følg vejledningen, og læs mere for at konfigurere miljøet. Naviger til mappen med navnet src"Lav en kopi eller brug mappen 2.
mitokondrier simulering luftig"og omdøbe det. Denne mappe indeholder alle de filer, der er relateret til simuleringen af træningsdataene. Der er tre sæt parametre, der skal indstilles til simuleringen.
Indstil først parametrene for antal mitokondrier, diameterområde, Z-akseområde og tæthed af fluorophorer til simulatoren i batchkonfigurationsfilen. Indstil derefter optiske parametre for numerisk blænde, forstørrelse og minimal bølgelængde af datasættet i filmikroskopetPSFmode. py"Indstil den ønskede værdi for pixelstørrelse og emissionsbølgelængde i branden generate_batch_parallel.
py"Indstil det tredje sæt parametre vedrørende outputdatasættet, som størrelsen på outputbilleder, antallet af fliser i hvert billede og antallet af samlede billeder i filen generate_batch_parallel. py"Kør filen generate_batch_parallel. py"for at starte simuleringen.
For at få billedet i den endelige størrelse skal du lave en kopi af mappen med navnet 5. Dataforberedelse og træning/dataforberedelse"og naviger ind i det. Indstil parametrene for batchnummer og antallet af billeder pr. batch, støjområde, der skal tilføjes i filen Data_generator.
py"Kør filen Data_generator. py"opret montagebillederne. Kopier mapperne med navnet billede"og segmenter" i datatrain / train"-mappen.
Dyb læringsbaseret segmentering. For at træne segmenteringsmodellen til en ny mikroskopbilledindstilling skal du navigere til mappen med navnet tog "og indstille parametrene for bach-størrelse, rygradsmodel for segmentering, antallet af epoker og læringshastighed for træning inde i filen med navnet train_unet. py"Kør filen train_unet.
py"at starte træningen. Træningsprocessen viser metrikken til evaluering af segmenteringsmodellen på det simulerede valideringssæt. Når træningen er afsluttet, gemmes modellen som best_model.
h5"i mappen med navnet tog"For at teste modellen på mikroskopbillederne skal billederne opdeles i den størrelse, der ønskes af togmodellen. For dette skal du navigere til mappen med navnet 6. Forbered testdata "og kopier PNG-formatfilerne af dataene til mappen PNG", og kør filen split_1024_256.
py"Dette vil skabe 256 x 256 størrelse afgrøder af billederne i datamappen. For at segmentere billedbeskæringer skal du gå til mappen med navnet 7. Test segmentering"og kør filen med navnet segment.
py"efter indstilling af navnet på den gemte model, der skal bruges. De segmenterede billeder gemmes i outputmappen. Morfologisk analyse.
Placer filen med navnet make_montage. py"ind i mappen med navnet 7. Test segmentering", og kør filen for at sy det segmenterede output tilbage til billedets oprindelige størrelse.
Opret en ny mappe med navnet 9. Morfologisk analyse"i kildemappen og naviger ind i den. Installer skan- og seabornbibliotekerne ved hjælp af kommandoen pip install seaborn skan"Segmenteringsmaskerne skeletteres ved hjælp af biblioteket ved navn skan"for at muliggøre analyse af topologien for den enkelte mitokondrion.
Placer filen i mappen 9. Morfologisk analyse"Arranger billederne af forskellige grupper af eksperimentet i forskellige mapper inde i mappen 7. Testsegmentering"Kør filen for at oprette plots til analysen. Resultater.
Den kvantitative analyse, der skal udføres, afhænger af forskningsspørgsmålene eller hypotesen. I vores eksperiment var vi interesserede i de tre forskellige morfologier af mitokondrier, nemlig prikker"små mitokondrier bits, stænger"fiberlignende eller streng som mitokondrier og flergrenede netværk"For at identificere morfologien skeleterer vi først segmenteringsoutputtet og analyserer grenforbindelserne i de forskellige klasser. Vi viser resultaterne af analysen for de to grupper af galactosertilpassede celler, kontrolgruppen og den CCCP-behandlede gruppe.
Vi ser en signifikant stigning i de gennemsnitlige grenlængder af prikker, hvilket forventes, da de svulmende mitokondrier gennemgår, når de udsættes for CCCP. Procentdelen af mitokondrier i individuelle længder af både stænger og netværksklasser reduceres signifikant i forhold til kontrollen, når cellerne er blevet behandlet med CCCP, hvilket bekræfter vores hypotese. Et udfordrende scenarie for vores metode er, når billedet har tætpakkede mitokondrier.
Den lyserøde farve angiver den længste enkelt mitokondrion registreret i billedet, hvilket skyldes den øgede fejl i segmenteringsresultaterne. Disse fejltilfælde kan påvises ved en kontrol af mitokondriernes længder og ved anvendelse af morfologiske operatorer. Mens vores ansøgning er et eksempel på, hvordan vi udførte analyse af mitokondriel morfologi, mener vi, at en sådan analyse og forskningsspørgsmål omkring den kan formuleres til forskellige aspekter af mitofagi og relaterede biologiske eksperimenter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
