قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة من الديدان الخيطية حافظت على وسائل الإعلام متينة مع الأشعة فوق البنفسجية قتل الغذائي الجرثومي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media. J. Vis. Exp. (27), e1152, doi:10.3791/1152 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الشيخوخة هي عملية التنكسية يتميز التدهور التدريجي لمكونات العضيات الخلوية ويؤدي إلى الوفاة. والدودة الخيطية

Protocol

الجزء 1 : إعداد النيماتودا نمو وسائل الإعلام (NGM) لوحات

هذا المقطع يصف إعداد لوحات NGM صلبة لاستخدامها في الحياة تجربة تمتد. وتمتد تجربة الحياة الأساسية يتطلب نوعين من اللوحات : لوحات NGM القياسية ، والتي لا تحتوي على مواد مضافة ، وألواح أمبير / FUDR ، والتي على حد سواء الأمبيسيلين (الأمبير) وfluorodeoxyuridine (FUDR) إضافة إلى NGM. يستخدم لمنع الأمبيسيلين التلوث الجرثومي الأجنبية. FUDR يمنع انقسام الخلايا ، ويقلل من انتاج البيض ، ويمنع البيض من الفقس. استخدام FUDR لتحليل طول العمر لا يؤثر على الكبار مدى الحياة ، ويزيل الحاجة لنقل الديدان كل بضعة أيام من أجل فصلها عن يرقة المتنامية. وكلا النوعين من البطولة مع لوحات E. البكتيريا القولونية OP50 الذي قتل لاحقا من قبل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

  1. إعداد NGM (انظر القسم 5 لصفة وتلاحظ التخزين) وألواح بتري التسمية. ستحتاج 1 60 ملم لوحة بيتري في 10 مل من NGM. إذا كنت بدأت مع NGM صلبة أعدت مسبقا ، انتقل إلى الخطوة 1.2. إذا كنت بدأت مع NGM تعقيمها طازجة ، انتقل إلى الخطوة 1.4.
  2. تذوب تماما NGM الصلبة عن طريق الميكروويف على ارتفاع 30 في نبضات الثانية. دوامة وسائل الاعلام بين نبضات لمنع فقاعات الغاز المضغوط من بناء.
  3. NGM مكان السائل في درجة حرارة 55 مئوية أو حمام مائي على مقاعد البدلاء لتبرد.
  4. مرة واحدة NGM تصل 55 درجة مئوية إضافة 33 ميكرولتر من FUDR 150 مم و 100 ميكرولتر من أمبيسيلين ملغ / 100 مل في NGM 100 مل (لأمبير / FUDR لوحات) ، ودوامة لالمزيج. لوحات NGM دون أدوية إضافية الانتقال مباشرة إلى الخطوة 1.5.
  5. باستخدام تقنية معقمة ، ماصة 10 مل NGM في كل لوحة بتري 60 مم. تجنب تشكيل فقاعات إذا أمكن ذلك. إذا شكل فقاعات لا يمكن برزت عليها عن طريق استخدام غيض ماصة.
  6. ترك لوحات على مقاعد البدلاء مع الأغطية على السماح NGM لترسيخ وجافة. إذا كان ذلك ممكنا ، وترك لوحات على مقاعد البدلاء لمدة 2 أيام قبل إضافة البكتيريا ، ولكنها ستعمل 1 يوم إذا كانت هناك حاجة لوحات عاجلا.
  7. في اليوم السابق لوحات الانتهاء من تجفيف السائل البذور ، والثقافة ، LB مع مستعمرة واحدة من مسحة جديدة من E. القولونية OP50 البكتيريا على أجار LB. يجب عليك إعداد ما لا يقل عن 1 مل من ثقافة OP50 بين عشية وضحاها في لوحة 60 ملم.
  8. مكان OP50 الثقافة في 37 درجة مئوية شاكر وتسمح للبكتيريا لتنمو بين عشية وضحاها (ثقافة ينبغي أن تصل إلى تشبع).
  9. بيليه OP50 البكتيريا عن طريق الدوران في 3500 ز لمدة 10 دقائق.
  10. إزالة 90 ٪ من البكتيريا وطاف resuspend التركيز الثقافة 10X.
  11. 100 ميكرولتر ماصة للثقافة 10X OP50 تتركز في وسط لوحات NGM طدت. لوحات دوامة بلطف لنشر ثقافة البكتيريا إذا لزم الأمر (البكتيريا بشكل مثالي ينبغي أن تغطي المنطقة الوسطى من NGM دون الاقتراب من الجدران لوحة). في محاولة لتجنب لمس طرف ماصة لسطح NGM ، وعيوب في السطح من وسائل الإعلام السماح لتحفر الديدان في NGM.
  12. ترك لوحات على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها للسماح البكتيريا الثقافة لتجف على NGM الصلبة (عادة ما يستغرق حوالي 24 ساعة).
  13. الجاف مرة واحدة ، فضح سطح لوحات لجرعة الأشعة فوق البنفسجية الكافية لتوقيف نمو البكتيريا. إذا كنت تستخدم الأشعة فوق البنفسجية Stratalinker Stratagene 2400 :
    • لوحات في مكان وإزالة الأغطية Stratalinker
    • إغلاق الأبواب وتشغيل Stratalinker
    • اضغط على "الطاقة"
    • أدخل ''9999 باستخدام لوحة المفاتيح
    • اضغط على "بدء"
    • سوف يتعرض للأشعة فوق البنفسجية لوحات لنحو 5 دقائق
  14. ويمكن تخزين لوحات للأشعة فوق البنفسجية مع البكتيريا قتل رأسا على عقب في 4 درجات مئوية ليصل إلى 1 في الشهر.

الجزء 2 : إجراء زرع البويضة توقيت الحصول على عصر متزامنة السكان من الحيوانات

في هذا القسم ونحن إنشاء السكان من الديدان مع تاريخ فتحة المشتركة. ويتم تحقيق هذا عن طريق السماح للبالغين التناسل لتضع بيضها على طبق من ذهب لفترة محددة من الزمن ، والسماح لمن لوضع البيض.

  1. (اختياري) نقل ما يقرب من 20 الديدان البالغة الشباب على طبق من ذهب من دون FUDR NGM الطازجة. ترك لوحات عند 25 درجة مئوية في النظام للسماح للنشر والديدان تأكل من خلال كل من المواد الغذائية البكتيرية. بعد أن تم استهلاك المواد الغذائية البكتيرية والديدان فقست حديثا دخول النمو القبض dauer المرحلة. سوف تبدأ لرؤية اليرقة حول dauer في غضون أسبوع ، اعتمادا على كيفية العديد من الديدان التي نقل على لوحة البداية. ويمكن استخدام Dauer اليرقة للخطوات المقبلة ليصل إلى 1 في الشهر.
  2. (اختياري) يرقة نقل dauer 20-30 لوحة NGM طازج بدون FUDR. سيكون في وجود اليرقة dauer الغذاء يصبحوا بالغين التناسل داخل 2 يوما ، وتبقى نشطة التناسل لبضعة أيام بعد ذلك عند 25 درجة مئوية.
  3. نقل 10-15 البالغين التناسل لوحة NGM طازج بدون FUDR. ويشار إلى هذه اللوحة كما زرع البويضة توقيت (هاتف) لوحة.
  4. ترك لوحة هاتف عند 25 درجة مئوية لمدة 6 ساعات من أجل السماح للرالديدان انه الوقت لتضع بيضها.
  5. إزالة الديدان البالغة من هاتف لوحة. ويمكن لوحة تفقد البصر للبيض قبل إزالة البالغين. يمكن إذا لم الديدان وضعت عددا كافيا من البيض أن تترك لوحة ابيب في 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى ما مجموعه 24 ساعة قبل إزالة الديدان البالغة.
  6. هاتف مكان لوحة عند 20 درجة مئوية حتى تفقس البيض والديدان وتطورت الى مرحلة اليرقات L4 (وهذا عادة ما يستغرق يوما ل2 نوع جيم ايليجانس البرية ، ولكن يمكن أن يستغرق وقتا أطول لحدة التوتر مع الظواهر التطور البطيء).

الجزء 3 : الحيوانات نقاط عن عمر

في هذا القسم نتبع العمر متزامنة سكان الجزء 2 من الديدان حتى وفاتهم. تتم المحافظة على الديدان أمبير / FUDR لوحات لمنع إنتاج البيض والتلوث الجرثومي وتعتبر بالرصاص عندما فشلوا في الاستجابة للمؤثرات الخارجية.

  1. L4 نقل اليرقة لوحات أمبير / FUDR المصنفة. لكونها اختبرت كل سلالة أو شرط ، هو نموذجي لإعداد لوحات 2-3 مع 25-30 الديدان في طبق من ذهب. صور للجيم وتقدم مراحل الحياة ايليجانس كمرجع (الشكل 1). 1
  2. مكان أمبير / FUDR لوحات عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. بعد 24 ساعة ، وتقييم بصريا الديدان ، والإعلام ، والبكتيريا. نقل الديدان لوحات الأمبير / FUDR جديدة اذا لوحظ أي من التالي :
    • قد أكلت الديدان معظم المواد الغذائية البكتيرية. سيكون في مرحلة مبكرة من حياة الديدان تجربة تمتد يتعين نقل 1-2 مرات في الاسبوع لمنع البكتيريا من نضبت.
    • وهناك عدد كبير من يرقات موجودة. هذا هو عادة إشارة إلى أن تم نقل الديدان لوحات أمبير / FUDR مثل البالغين الصغار بدلا من L4s وكانوا قادرين على وضع بعض البيض قبل FUDR حيز التنفيذ. سوف FUDR عموما منع اليرقات من النمو في البالغين الكامل ، ولكن أحيانا قليلة سوف تنمو لتصبح الكبار وأصبح الخلط بينه وبين حيوانات التجارب.
    • ويلاحظ والبكتيريا تعيش / المتنامية. عموما ، فإن الجمع بين الأمبير والأشعة فوق البنفسجية ، مما أسفر عن مقتل ضمان عدم تلوث البكتيريا تعيش هذه التجربة ، ولكن يحدث أحيانا عليه.
    • ويلاحظ نمو الفطريات على وسائل الإعلام. إذا اشتعلت في وقت مبكر بما يكفي ، وعادة ما يكون نمو الفطريات قصها باستخدام ملعقة أو ماصة الحافة. بمجرد أن تنمو لتكون أكبر من بضعة ملليمترات في القطر فإنه عادة ما يكون أسهل لنقل الديدان لوحة جديدة.
    • باستخدام نطاق تشريح ، وتحديد ما إذا كان كل دودة حيا أو ميتا.
    • اضغط برفق لوحة. الدودة على قيد الحياة إذا كان يتحرك في استجابة للتنصت.
    • إذا الدودة لا يستجيب إلى الاستفادة من لوحة ، والتكبير في منطقة الرأس.
    • اضغط على رأس الدودة بلطف مع اختيار نقل البلاتين. درجة الدودة عاطل إذا لم يستجب عن طريق تحريك رأسه.
    • ويمكن إزالة الديدان الميتة من اللوحة.
  4. تسجيل التاريخ وعدد الديدان التي لا تزال حية وميتة.
  5. عودة لوحات إلى 20 درجة مئوية.
  6. كرر الخطوات من خلال 3.3 3.6 كل 2 إلى 3 أيام حتى عن الديدان لقوا حتفهم.

الجزء 4 : النتائج الممثل.

البيانات الخام التي تنتجها فترة تجربة حياة الديدان الخيطية هي قائمة التواريخ مع الأرقام المقابلة من الديدان التي لا تزال حية وميتة لكل سلالة اختبارها. هو مقلوب عادة عدد من الديدان التي تموت في كل يوم لحساب نسبة من الديدان على قيد الحياة في كل يوم (الشكل 2A) ، والتي يتم رسم بياني كما منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 2B ، واليوم من وضع البيض توقيت يعتبر اليوم 0 ). ويمكن حساب العمر الافتراضي لكل دودة الفردية في هذه الدراسة من عدد من الديدان التي تموت في كل يوم ، والمستخدمة لحساب المتوسط ​​ومتوسط ​​العمر الافتراضي للمقارنة بين السلالات. لا يتم استخدام عدد من عدد من الديدان على قيد الحياة في كل يوم مباشرة في تحليل مدى الحياة. وحافظت على الديدان وسائل الاعلام الصلبة أحيانا "الفرار" ، أو الزحف إما أن جدار أو أسفل لوحة تحت وسائل الإعلام. ويمكن استخدام عدد من الديدان على قيد الحياة في كل يوم لتحديد كيفية العديد من الديدان هرب طوال فترة التجربة. عادة ما يتم إزالة الديدان التي الفرار من التحليل. كمعيار ، فإن نموذجي عمر وسيطة لN2 ، وجيم ايليجانس البرية من نوع السلالة ، حافظت على البكتيريا الأشعة فوق البنفسجية في قتل 20 درجة مئوية تقريبا قياس 25 يوما اعتبارا من البيض.

الجزء 5 : حلول

الديدان الخيطية وسائط النمو (NGM) ، و 100 مل :
الجمع :
0.3 غرام كلوريد الصوديوم
0.25 ز الببتون مادة تنشأ عن البروتينات
2 ز آغار
الأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة ، والسماح لتبرد إلى 55 درجة مئوية ، ثم تضاف :
100 ميكرولتر 1 م MgSO 4
100 ميكرولتر 5 ملغ / مل نسبة الكولسترول في الدم
100 ميكرولتر 1 م CaCl2
1.625 مل 1.5 درجة الحموضة KPI 6.0 M
ويمكن استخدام NGM السائل على الفور من أجل السماح لوحات أو لترسيخ وتخزين طويل الأجل في درجة حرارة الغرفة
مرق لوريا (LB) ، 1L :
10 ز BactoTryptone
5 ز مستخلصات الخميرة
10 ز كلوريد الصوديوم
10 مل 1 م تريس 8.0 درجة الحموضة
1 لتر منزوع الأيونات الماء
الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
1 م MgSO 4 ، 300 مل :
ز 73.95 MgSO 4
300 مل منزوع الأيونات الماء
الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
5 ملغ / مل نسبة الكولسترول في الدم ، و 200 مل :
1 غرام كولسترول
200 مل 100 ٪ من الإيثانول
فلتر تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
1 م CaCl 2 ، 500 مل :
ز 27.75 CaCl 2
500 مل منزوع الأيونات الماء
فلتر تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
1.5 M KPI الرقم الهيدروجيني 6.0 ، 1L :
الجمع :
31.4 ز KPI ثنائي القاعدة
179.6 ز KPI أحادي القاعدة
850 مل منزوع الأيونات الماء
الحرارة في حين خلط للسماح KPI إلى أن يذوب في الحل. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 هيدروكسيد الصوديوم مع N 10.
يضاف الماء منزوع الأيونات للام 1
الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
1 م تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 :
ز 60.57 تريس
400 مل منزوع الأيونات الماء
ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 مع حمض الهيدروكلوريك.
يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 500 مل.
فلتر تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
150 ملم Fluorodeoxyuridine (FUDR) ، و 10 مل :
0.3693 ز FUDR
10 مل منزوع الأيونات الماء المعقم
المحل في -20 درجة مئوية.
100 ملغ / مل أمبيسيلين (الأمبير) ، و 10 مل :
1 غرام أمبيسيلين
10 مل منزوع الأيونات الماء المعقم
المحل في -20 درجة مئوية.
50 ملغ / مل كربنيسيلين (كارب) ، و 10 مل :
500 ملغ كربنيسيلين
10 مل منزوع الأيونات الماء المعقم
المحل في -20 درجة مئوية.
1 الآيزوبروبيل M β - D - Thiogalactopyranoside (IPTG) ، و 10 مل :
2.38 ز IPTG
10 مل منزوع الأيونات الماء المعقم
المحل في -20 درجة مئوية.

الشكل 1
الشكل 1. الصور من حقل جيم برايت ايليجانس مراحل الحياة ، بما في ذلك البيض ، وأربع مراحل اليرقات (L1 -- L4) ، وتعليم الكبار. جميع لوحات المعرض المخنثين باستثناء اليمين السفلي ، مما يدل على الذكور البالغين (صورة من الخشب (1988)).

الشكل 2
النتائج الممثل الشكل 2. من جيم ايليجانس التجربة مدى الحياة البرية مقارنة N2 سلالة لنوع سلالة تحتوي على طفرة في جين داف - 2. (أ) جدول يبين البيانات التي تم جمعها ، بما في ذلك عدد الأيام منذ الديدان والبيض وعدد من ديدان ميتة لاحظ في كل يوم ، والنسبة المئوية من العينة الأصلية الباقية على قيد الحياة في كل يوم (محسوبة اعتبارا من التهم اليومية للديدان ميتة) . (ب) البقاء منحنيات المقابلة للبيانات المقدمة في عمر (A).

الشكل 3. مقارنة بين ممثل lipofuscin جيم البالغين الصغار والكبار ايليجانس. وتظهر الصور على اليسار الحقل مشرق ودابي الصور قناة مضان على اليمين. لوحات تظهر أعلى دودة 4 ايام لوحات قديمة وتظهر أسفل دودة 11 يوما من العمر (مقاسا من البيض).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد درس التحكم الجيني للتعمير على نطاق واسع في C. ايليجانس ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى سهولة والسرعة التي يمكن أن تحدد مدى الحياة. بروتوكول مناقشتها في هذه المقالة إطارا أساسيا للحصول على بيانات عمر استنساخه في C. ويمكن أيضا ايليجانس ويمكن تطبيقها على الأنواع relatednematode 2 بجعل بعض التعديلات البسيطة يمكن تكييف هذه الإجراءات لقياس مدى الحياة في إطار مجموعة من الشروط. هنا سوف نناقش الاختلافات الشائعة عدة ، بما في ذلك البكتيريا الحية ، وتدخل الحمض النووي الريبي (رني) ، وتقييد الغذائية بالحرمان البكتيرية ، وNGM خال من المخدرات.

ربما كان التغير الأكثر شيوعا من هذا البروتوكول هو الحفاظ على الديدان على البكتيريا الحية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال جعل بعض التغييرات الطفيفة. أولا ، إجراء تغيير لوحات البذر مع البكتيريا (1.7 الخطوات من خلال 1.13). بدلا من تزايد OP50 الثقافات من التشبع ، وتنمو حتى منتصف المرحلة وسجل 200 ميكرولتر ماصة على لوحات مباشرة من ثقافة السائل. السماح للبكتيريا لتنمو على لوحات أكثر من ليلة وحذفت التعرض للأشعة فوق البنفسجية. وينبغي أيضا أن تستبعد من الأمبيسيلين لوحات مع FUDR. ميزة لاستخدام البكتيريا الحية هو أن الديدان لا بد من نقل في كثير من الأحيان إلى لوحات جديدة ، لأن الطعام الجرثومي هو على قيد الحياة والنمو. مساوئ العيش الغذائي الجرثومي هو أن OP50 غير الممرضة للجيم ايليجانس 3 نمت على الديدان والبكتيريا تعيش فترة أقصر من الديدان تعيش البكتيريا نمت على الأشعة فوق البنفسجية قتل (3) الذي يمكن أن يحتمل قناع عمر الظواهر المرتبطة بالشيخوخة. متوسط ​​العمر الافتراضي على البكتيريا تعيش حوالي 20 يوما.

ويتم إنجاز بسهولة عن طريق الجينات نهدم رني في C. ايليجانس بتعديل طعامهم البكتيرية بحيث تنتج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي المقابلة لجين أن تكون ترسيتها. مكتبتين رني البكتيرية المتاحة التي تغطي أكثر من 90 ٪ من إطارات القراءة المفتوحة في C. ايليجانس الجينوم. 4-9 لاستخدام رني في سياق مدى الحياة ، والاستعاضة عن البكتيريا OP50 مع استنساخ رني من الاهتمام ومتابعة التعديلات التي نوقشت في الفقرة السابقة لقياس مدى الحياة على بكتيريا حية. المكتبات رني استخدام البلازميد نظام يستند التعبير. يتم تحديد البلازميد لاستخدام شريط المقاومة كربنيسيلين والتعبير من الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل المزدوج الناجم عن الآيزوبروبيل β - D - thiogalactopyranoside (IPTG). وكلا كربنيسيلين IPTG الحاجة إلى إدراجها في لوحات NGM. تعديل الخطوة 1.4 بإضافة 100 ميكرولتر IPTG 1 م و 50 ميكرولتر كربنيسيلين 50 ملغ / مل لكل 100 مل NGM لكلا النوعين من لوحات. الأمبيسيلين لا تحتاج إلى أن تضاف إلى أي نوع من لوحة ، ومنذ كربنيسيلين يفي نفس الدور.

تقييد التدخل الغذائي هو الأكثر دراسة على نطاق واسع لإبطاء الشيخوخة عبر الأنواع المتباينة تطويريا. في C. ووصف شكل من أشكال التقييد الغذائية لوحظ ايليجانس ، تمديد فترة الحياة القصوى على وسائل الاعلام الصلبة عندما يتم إزالتها بالكامل مصدر الغذاء الجرثومي خلال مرحلة البلوغ ، والحرمان من البكتيريا دينار بحريني () 9 و 10 لقياس مدى الحياة في سياق دينار بحريني ، وجعل تعديلين على البروتوكول أعلاه. أولا ، إعداد والنوع الثالث من لوحة. وينبغي أن تكون هذه اللوحات لوحات مماثلة لالأمبير / FUDR باستثناء تفتقر إلى مصدر الغذاء الجرثومية. الثاني ، تعديل الجزء 3 لتشمل خطوة خطوة إضافية بين 3.2 و 3.3 الخطوة. في يوم 4 من سن البلوغ (4 أيام بعد نقل اليرقات إلى L4 الأمبير / FUDR) نقل الديدان دينار بحريني إلى الأمبير / FUDR وحات تفتقر البكتيريا. واحد المضاعفات المرتبطة بهذا الشكل من التقييد الغذائي هو ميل الديدان على الفرار. في غياب الأغذية والديدان لا تبقى بالقرب من مركز للوحة ، لكنه سيزيد من منطقتهم التنقيب بحثا عن الطعام. نتيجة لذلك ، فإن أكبر جزء من الديدان تزحف فوق جدران لوحة ويجفف. نرى في كثير من الأحيان 50 ٪ إلى 70 ٪ من الحيوانات الفرار بعد نقله الى لوحات دينار بحريني. لمعالجة هذه المسألة ، مع بدء ثلاثة أضعاف الديدان كثيرة من أجل الحصول على عدد كبير المتبقية على لوحات ما بعد الرحلة. ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع BD الغذائي الجرثومي العيش مع أي تعديلات إضافية ، أو مع تعديل واحد رني إضافية. للدينار بحريني مع رني ، يجب إضافة مضاد حيوي إضافية إلى لوحات لمنع البكتيريا من دون نقل البكتيريا مع الديدان من النمو وتوفير مصدر الغذاء غير المرغوب فيها. مثالين والتتراسيكلين والكاناميسين ، سواء التي يمكن أن تضاف إلى لوحات FUDR دون طعام الجرثومي خلال الخطوة 1.4. ويمكن أيضا أن يكون بحريني بدأت في وقت مبكر من يوم 2 مرحلة البلوغ أو في وقت متأخر 14 يوما من سن الرشد ، مع عدم وجود تأثير كبير على مدى الحياة. 10

التعديل الأخير الذي سنناقش هو قياس مدى الحياة على لوحات NGM دون أدوية إضافية (مثل الأمبيسلين أو FUDR). ويمكن تحقيق هذاببساطة ليست من قبل إضافة إلى الأدوية NGM خلال الخطوة 4 وإضافة خطوة إضافية في الجزء 3. دون FUDR سوف الديدان مواصلة وضع البيض وإنتاج اليرقات. خلال مرحلة الإنجاب (حوالي الأسبوع الأول من مرحلة البلوغ) وجميع الديدان التجريبية أن يتم تحويلها الى لوحات جديدة كل يوم 2 إلى فصلها عن أبنائهم.

جيم ايليجانس hermaphroditic هي في المقام الأول مع نادر الحدوث من الذكور. ويقاس عادة مدى الحياة لالمخنثين فقط ، ولكن يمكن أيضا أن تقاس بالنسبة للذكور. هناك نوعان من التحديات المرتبطة بالعمل مع جيم الذكور ايليجانس. الأول هو الحصول على كمية كبيرة من الديدان الذكور ، كما خنثى الذاتي التسميد تنتج نسبة ضئيلة جدا من نسل الذكور (0.1 ٪) 11 حالما يتم التوصل إلى السكان الذكور تحتوي على الديدان ، ذكور / خنثى التزاوج تنتج بأعداد متساوية تقريبا من الذكور و تمسك المخنثين طالما الديدان في وجود الغذاء ، ويمكن أن يؤمر على 12 سهما ذكر من مركز علم الوراثة انواع معينة أو التي تم إنشاؤها بواسطة فحص البصر للذكور المؤسسين المنتجة من خنثى ذاتية التلقيح. التحدي الثاني هو سلوك الذكور ونظافتها. في غياب أي طعام أو الأقران المحتملين (المخنثين) والديدان الذكور إدخال النمط السلوكي البحث ينطوي على مجموعة واسعة من الحركة. 13 عندما حافظت على لوحات النتائج هذا السلوك في جزء كبير من الفارين من الديدان حتى الجدران لوحة وتجفيف . طريقة عامة للتعامل مع هذه الصعوبة هو ببساطة أن تبدأ مع الذكور يكفي أن عددا كبيرا تبقى بعد أكثر فروا.

وبصرف النظر عن العمر ، سن مشترك المرتبطة النمط الظاهري هو lipofuscin التراكم. Lipofuscin هي النفايات الخلوية المعقدة التي لا يمكن المتدهورة التي تتراكم في الخلايا مع العصر ، وتستخدم العلامات البيولوجية للشيخوخة في C. يمكن ايليجانس 14 ، 15 تتفلور Lipofuscin ويمكن تصور بسهولة في C. ايليجانس باستخدام قناة دابي من مضان المجهر (الشكل 3). ويمكن تصور أن يكون Lipofuscin تراكم في الديدان التي احرز لعمر مباشرة على لوحات NGM ، مما يسمح بجمع النمط الظاهري ثانوية مفيدة بالتوازي مع عمر.

بالإضافة إلى مدى الحياة ، ويمكن أيضا للبروتوكول وصفها في هذه المادة يمكن استخدامها لدرجة التقدم المظهري من الشلل في سن المرتبطة بها في C. نماذج ايليجانس المرض proteotoxicity 16 عندما يصبح مشلولا دودة يصبح غير قادر على الزحف عبر لوحة ، ولكن يمكن ان تتحرك لا يزال رئيسا لها. يتم احتسابه دودة بالشلل كما لو أنه فشل في التحرك بالنسبة للNGM استجابة لوحة التنصت أو الحث مع البلاتين اختيار نقل ، ولكن لا تحرك رأسها. الديدان التي تموت عادة الاحتفاظ درجة الشلل (شلل أو مشلولا لا) انها منحت خلال الملاحظة ويعيش معظم الأخيرة. الأهم من ذلك ، حتى البرية نوع C. أصبحت مشلولة ايليجانس مع التقدم في العمر المتقدم. لهذا الشلل هو عادة سبب لعدم وسجل للديدان مضى عليها أكثر من 20 يوما تقريبا ، وبعد هذه النقطة يصبح من الصعب التمييز بين الشلل الناجم عن الشيخوخة الطبيعية والشلل الناجم عن تطور المرض proteotoxicity.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال الاختراقات غلين / تلعفر في المعاهد الوطنية للصحة وعلم الشيخوخة جائزة المنحة 1R01AG031108 - 01 إلى MKGS معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح التدريب P30AG013280. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agar Reagent Fisher Scientific DF0145-17-0 (214530)
Ampicillin Reagent MidSci 0339
BactoTryptone Reagent Fisher Scientific DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone Reagent Fisher Scientific DF0118-17-0 (211677)
CaCl2 Reagent Fisher Scientific NC9699248 (1332-01)
Carbenicillin Reagent Gold Biotechnology C0109
Cholesterol Reagent Sigma-Aldrich C75209
Fluorodeoxyuridine (FUDR) Reagent Sigma-Aldrich F0503
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Reagent Gold Biotechnology I2481C5
KPi Dibasic Reagent Fisher Scientific 5087862 (3252-01)
KPi Monobasic Reagent Fisher Scientific 5087861 (3246-01)
MgSO4 Reagent Fisher Scientific NC9561800 (2500-01)
NaCl Reagent Fisher Scientific S251
Tris Reagent Sigma-Aldrich T1503
Yeast Extract Reagent Fisher Scientific DF0886-17-0 (288620)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).
  2. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes. Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).
  3. Garigan, D. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
  4. Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6, 525-523 (2007).
  5. Curran, S. P., Ruvkun, G. Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability. PLoS Genet. 3, e56-e56 (2007).
  6. Dillin, A. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  7. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
  8. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genet. 1, 119-128 (2005).
  9. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33, 40-48 (2003).
  10. Smith, E. D. Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans. BMC Dev Biol. 8, 49-49 (2008).
  11. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91, 67-94 (1979).
  12. Emmons, S. W., Sternberg, P. W. C. ELEGANS II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).
  13. Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24, 7427-7434 (2004).
  14. Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 21, 4089-4095 (1982).
  15. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  16. Steinkraus, K. A. Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7, 394-404 (2008).

Comments

4 Comments

  1. do dead c.elegans represent lipofuscin measurement?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2010 - 11:46 AM
  2. Please tell how to do life span experiments on Nano particle in respect of C.elegans.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2010 - 7:26 AM
  3. DŒs egg laying completely stop after adding FUdR in medium? Which worms (L1 or L² or L3 or L4) should be transfered to FUdR plate so the Egg laying not take place?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2010 - 8:12 AM
  4. The primary role of FUdR is to prevent egg hatching, not egg laying, though we typically see some reduction in egg production. FUdR will also interfere with cell division in the developing animal, so you have to wait until all of the somatic cell division is finished. Transfer the animals to FUdR at the L4 stage to prevent egg hatching without interfering with development.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2010 - 12:07 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics