Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media. J. Vis. Exp. (27), e1152, doi:10.3791/1152 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yaşlanma, hücresel bileşenleri ve ölüm ile sonuçlanan organelleri ilerleyici bir bozulma ile karakterize dejeneratif bir süreç. Nematod

Protocol

Bölüm 1: hazırlayın nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları.

Bu bölümde, ömrü deneyde kullanılmak üzere sağlam NGM plakaların hazırlanmasında açıklamaktadır. Ampisilin (Amp) ve NGM eklendi fluorodeoxyuridine (FUDR) hiçbir katkı maddesi ve Amp / FUDR tabak, içeren standart NGM tabak, temel bir ömrü deney iki tip plakalar gerektirir. Ampisilin yabancı bakteri bulaşmasını önlemek için kullanılır. FUDR, hücre bölünmesini inhibe yumurta üretimini azaltır, ve kuluçkalık yumurta engeller. Uzun ömürlü analiz için FUDR yetişkin kullanım ömrü etkileyecek ve birkaç gün büyüyen larva onları ayırmak için her solucanları aktarmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Her iki tür plakaların E. ile seeded sonradan UV ışınlarına maruz tarafından öldürülen coli OP50 bakteri.

  1. NGM (tarifi ve depolama notları için bkz: Bölüm 5) ve etiket petri tabak hazırlayın. NGM 10 ml başına 1 60 mm petri tabak gerekir. Önceden hazırlanmış katı NGM ile başlayan iseniz, 1.2 adıma geçin. Taze otoklavlanmış NGM ile başlayan iseniz, 1.4 adıma geçin.
  2. Tamamen katı NGM 30 saniyelik bakliyat yüksek mikrodalga eritebilir. Kadar bina basınçlı gaz kabarcıklarını engellemek için bakliyat arasındaki Swirl medya.
  3. 55 ° C su banyosu ya da soğutmak için bankta Yeri sıvı NGM.
  4. Bir kez NGM ulaştığında 55 ° C, 150 mM FUDR 33 mcL ve 100 mg / ml, 100 ml NGM başına ampisilin (Amp / FUDR plakalar için) ve karıştırın girdap 100 mcL ekleyin. NGM plakaları için ek ilaçsız, 1.5 adıma doğrudan geçin.
  5. Her 60 mm petri tabak içine steril tekniği, pipetle 10 ml NGM kullanma. Mümkünse kabarcıklar oluşturan kaçının. Kabarcıkları varsa, bunlar bir pipet kullanarak attı.
  6. NGM katılaşmaya ve kuru izin kapaklarını bankta plakaları bırakın. Mümkünse, bakteri eklemeden önce 2 gün boyunca bankta plakaları bırakın ama plakaları er ihtiyaç vardır 1 gün çalışacaktır.
  7. Günü plakaları E. taze bir çizgi tek bir koloni ile kurutma, tohum sıvı LB kültür bitirmeden önce LB agar coli OP50 bakteri. 60 mm plaka başına bir gecede OP50 kültürünün en az 1 ml hazırlamalıdır.
  8. 37 Yeri OP50 kültür ° C çalkalayıcı ve bakteriler (kültür doygunluk ulaşmak olmalıdır) gece boyu büyümeye izin verir.
  9. Pelet OP50 10 dakika boyunca 3.500 g iplik bakteri.
  10. Süpernatant ve tekrar süspansiyon bakteri kültürü 10x konsantre% 90 çıkarın.
  11. Pipet 100 mcL 10x konsantre OP50 kültür merkezi haline katılaşmış NGM plakalar. (Ideal bakteriler plaka duvarları yakınında gelmeden NGM merkezi alanı kapsamalıdır) gerekirse Swirl plakaları yavaşça bakteri kültürü yaymak için. Medya yüzey kusurları NGM içine yuva solucanlar izin verdiği ölçüde, NGM yüzeye pipet dokunmaktan kaçınmak için deneyin.
  12. Bakteri kültürü katı NGM (genellikle 24 saat sürer) üzerinde kurumasına izin gecede bankta plakaları bırakın.
  13. Kuruduktan sonra, plakaların yüzey bakterilerin büyüme durması için yeterli bir UV dozu maruz. Bir Stratagene UV Stratalinker 2400 kullanıyorsanız:
    • Yeri Stratalinker plakaları ve kapakları kaldırmak
    • Kapıyı kapatın ve Stratalinker açmak
    • Basın 'Enerji'
    • '9999 'Tuş takımını kullanarak girin
    • Press 'Başlat'
    • Plakalar yaklaşık 5 dakika süreyle UV ışınlarına maruz kalacağı
  14. UV-öldürülmüş bakteri ile Tabaklar, 4 ° C 1 aya kadar baş aşağı saklanabilir.

Bölüm 2: zamanlanmış bir yumurta hayvanların yaş senkronize bir nüfus elde etmek için döşeme gerçekleştirin.

Bu bölümde ortak bir ambar güncel solucanları bir nüfusa üretir. Bu üreme aktif yetişkin için zaman belirli bir süre için bir plaka üzerine yumurtalarını bırakmak için izin ve bu yumurtaları geliştirmek için izin gerçekleştirilir.

  1. (Isteğe bağlı), yaklaşık 20 genç erişkin solucanlar FUDR olmadan yeni bir NGM plaka aktarın. 25 ° C, solucanlar, tüm bakteri gıda yoluyla yaymak ve yemek sağlamak amacıyla plakaları bırakın. Yeni yumurtadan çıkan solucanlar bakteriyel gıda tüketilen edildikten sonra tutuklanan büyüme Dauer sahne girecek. Başlangıçta plaka transfer kaç solucanlar bağlı olarak, bir hafta içinde yaklaşık Dauer larva görmeye başlayacaksınız. Dauer larva 1 ay kadar bir sonraki adımlar için kullanılabilir.
  2. FUDR olmadan taze NGM plaka (İsteğe bağlı) Transfer 20 30 Dauer larva. , 2 gün içinde üreme aktif yetişkin gıda Dauer larva varlığı haline gelecektir ve bundan sonra 25 üreme birkaç gün boyunca aktif kalır ° C
  3. 10 ila 15 üreme aktif yetişkin FUDR olmadan yeni bir NGM plaka aktarın. Bu plaka Zamanlı yumurtlama (TEL) plaka olarak adlandırılır.
  4. 25 ° C 6 saat için izin vermek için TEL plaka bırakınsolucanlar zaman yumurtalarını bırakmak için.
  5. TEL plaka erişkin solucanlar çıkarın. Plaka yetişkin çıkarmadan önce yumurta için görsel olarak kontrol edilebilir. TEL plaka, solucanlar, yeterli sayıda yumurta koydu varsa erişkin solucanlar çıkarmadan önce 24 saat olmak üzere toplam 25 ° C kadar sol olabilir.
  6. Place TEL plaka 20 ° C yumurtadan yumurta var ve solucanlar L4 larva dönemi (bu genellikle vahşi tip C. elegans için 2 gün sürer, ama yavaş gelişimi fenotipleri suşları için uzun sürebilir) için geliştirdiği kadar.

Bölüm 3: Puan hayvanların ömrü

Ölünceye kadar bu bölümde Bölüm 2 solucanlar yaş senkronize nüfus izleyin. Worms, yumurta üretimi ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için Amp / FUDR tabak tutulur ve dış uyaranlara yanıt vermeyen ölü olarak kabul edilir.

  1. Numaralı seribaşı Amp / FUDR plakaları L4 larva transferi. Her bir gerginlik ya da koşulu test için, plaka başına 25-30 solucanlar ile 2-3 tabak kurmak için tipik bir örneğidir. C. Görüntüler elegans yaşam evrelerinde referans verilmektedir (Şekil 1) 1
  2. Place Amp / FUDR plakaları 20 ° C 24 saat boyunca.
  3. 24 saat sonra, görsel, solucanlar, medya, ve bakteri değerlendirmek. Aşağıdakilerden herhangi birini görülmektedir taze Amp / FUDR plakaları solucanlar transferi:
    • Worms bakteriyel gıda yemiş. Erken, ömrü deney solucanlar tükenmiş olan bakterileri önlemek için bir hafta 1 ila 2 kez transfer edilebilir olacaktır.
    • Larvaların önemli bir kısmı mevcuttur. Bu genellikle solucanlar L4s yerine genç yetişkinler olarak Amp / FUDR plakaları ve FUDR yürürlüğe girmiştir önce bazı yumurtalarını bırakmak için mümkün olduğu bir göstergesidir. FUDR genellikle tam yetişkin içine büyüyen larva önlemek, ancak bazen bir kaç yetişkin içine büyümek ve deney hayvanları ile karıştırılmamalıdır olacak.
    • Canlı / büyüyen bakteriler gözlenir. Genel olarak, Amp ve UV-öldürme arada hiçbir canlı bakteri deney kontamine sağlayacaktır, ancak zaman zaman ortaya çıkar.
    • Mantar büyüme medya görülmektedir. Yeterince erken yakalanmış ise, mantar üremesine genellikle bir pipet veya spatula kullanarak kesip olabilir. Bir kere, birkaç milimetre çapında yeni bir plaka solucanlar aktarmak için genellikle daha kolaydır daha büyük olması yetişir.
    • Diseksiyon kapsamı kullanarak, her solucan, canlı ya da ölü olup olmadığını belirlemek.
    • Plaka hafifçe dokunun. Solucan dinlenmesine tepki olarak hareket ederse canlıdır.
    • Solucan başkanı bölgeye dokunarak levha, zoom için yanıt vermezse.
    • Platin transfer mızrapla solucan kafasını hafifçe dokunun. Puan başını hareket ettirerek yanıt vermemesi durumunda ölü olarak solucan.
    • Ölü solucanlar plaka çıkarılabilir.
  4. Canlı ve ölü bir tarih ve solucanlar sayısını kaydedin.
  5. 20 ° C'ye kadar plakaları dön
  6. Tüm solucanların ölmüş kadar tekrarlayın 3.3 3.6 sayesinde her 2 ila 3 gün adımları.

Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları.

Bir nematod ömrü deneyi tarafından üretilen ham veri, numaralarını içeren test her bir suş için canlı ve ölü solucanları tarihleri ​​bir liste. Her gün ölen sayısı solucanlar genellikle, bir hayatta kalma eğrisi (Şekil 2B olarak grafiksel olarak çizilen her gün canlı solucanlar oranı (Şekil 2A), hesaplamak için ters; Zamanlı yumurtlama günü 0. gün olarak kabul edilir .) Çalışmada her bir solucan için ömrü, her gün ölen solucanlar sayısı hesaplanır ve suşları arasında karşılaştırma için ortalama ve medyan yaşam süresi hesaplamak için kullanılabilir. Her gün canlı solucanlar sayısı sayımı ömrü analizi doğrudan kullanılmaz. Worms katı ortam üzerinde muhafaza bazen 'kaçmak', ya da medya altındaki plaka veya aşağı duvar ya tarama. Her gün canlı solucanlar deney kurs boyunca pek çok solucan, nasıl kaçtı sayısını belirlemek için kullanılabilir. Kaçmak Solucanlar genellikle analiz kaldırılır. N2, C. için bir kriter olarak, tipik bir medyan yaşam süresi 20 UV-öldürülmüş bakteri muhafaza elegans yabani tip gerilim ° C yumurtadan ölçülen yaklaşık 25 gündür.

Bölüm 5: Çözümler

Nematodu Büyüme Medya (NGM), 100 ml:
Birleştirin:
0,3 g NaCl
0.25 g Pepton
2 g Agar
40 dakika otoklav ve soğuması ile 55 ° C, sonra ekliyorum:
100 mcL 1 M MgSO 4
100 mcL 5 mg / ml Kolesterol
100 mcL 1 M CaCl2
1.625 ml 1.5 M KPI pH 6.0
Sıvı NGM oda sıcaklığında plakaları dökmek için hemen kullanılabilir veya sağlamlaştırmak için izin ve uzun vadeli saklanır.
Luria Broth (LB), 1L:
10 g BactoTryptone
5 g Maya Ekstraktı
10 g NaCl
10 ml 1 M Tris pH: 8.0
1 L deiyonize su
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
1 M MgSO 4, 300 mL:
73,95 g MgSO 4
300 mL deiyonize su
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
5 mg / ml Kolesterol, 200 mL:
1 g kolesterol
200 mL % 100 etanol
Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza.
1 M CaCl 2, 500 ml:
27,75 g CaCl 2
500 mL deiyonize su
Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza.
1.5 M KPI pH 6.0, 1L:
Birleştirin:
31.4 g KPI dibazik
179,6 g KPI tekbazlı
850 mL deiyonize su
Isı KPI çözüm çözünmesi için karıştırma sırasında. 10 N NaOH ile pH 6,0 'a ayarlayın.
1 L. deiyonize su ekleyin
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
1 M Tris, pH 8.0:
60,57 g Tris
400 mL deiyonize su
HCl ile pH 8.0 ayarlayın.
500 mL deiyonize su ekleyin.
Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza.
150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml:
0,3693 g FUDR
10 ml steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza
100 mg / ml ampisilin (Amp), 10 ml:
1 g Ampisilin
10 ml steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza
50 mg / ml Carbenicillin (Carb), 10 ml:
500 mg Carbenicillin
10 ml steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza
1 M İzopropil β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:
2.38 g IPTG
10 ml steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza

Şekil 1
Şekil 1. C. Aydınlık alan görüntüler yumurta da dahil olmak üzere elegans yaşam evreleri, dört larva aşamaları (L1-L4) ve yetişkin. Tüm paneller, yetişkin bir erkek (Wood (1988) Image), sağ alt hariç hermafroditlerde göstermektedir.

Şekil 2
C. Şekil 2 Temsilcisi sonuçları elegans ömrü deneyi daf-2 genindeki bir mutasyon içeren bir yük vahşi tip suşu N2 karşılaştırarak. (A) toplanan solucanların yumurtaları beri gün sayısı da dahil olmak üzere veriler, her gün görülen ölü solucanlar sayısını, ve her gün hayatta kalan orijinal numunenin yüzdesi (ölü solucanlar günlük sayıları hesaplanan) gösteren bir tablo . (B) Survival ve (A) ömrü verilere karşılık gelen eğriler.

Şekil 3 genç ve yaşlı yetişkin C arasında lipofusin Temsilcisi karşılaştırma elegans. Aydınlık alan görüntülerin sağ ve sol DAPI kanal floresan görüntüler gösterilir. En paneller 4 gün eski bir solucan ve alt paneller (yumurta ölçülen gibi) 11 gün eski solucan göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uzun ömürlü genetik kontrol C. yaygın olarak incelenmiştir elegans, büyük ölçüde ömrü tespit edilebilir olan kolaylığı ve hızı nedeniyle. Bu makalede açıklanan protokol C. tekrarlanabilir ömrü veri elde etmek için temel bir çerçeve tanımlar elegans ve relatednematode türler için de uygulanabilir. 2, bu işlemler çok çeşitli şartlar altında ömrü ölçmek için adapte edilebilir basit bazı değişiklikler yaparak . Burada RNA enterferans (RNAi), bakteriyel yoksunluk diyet kısıtlaması ve uyuşturucu ücretsiz NGM, canlı bakteriler de dahil olmak üzere birçok genel varyasyonlarını ele alınacaktır.

Muhtemelen bu protokolü en yaygın varyasyon canlı bakteri solucanlar bakım. Bu, birkaç küçük değişiklikler yaparak yapılabilir. Birincisi, bakteriler (1.7 - 1.13 üzerinden adımları) ile plakalar ekim için prosedür değiştirin. Doygunluk OP50 kültürler büyüyen yerine, 200 mcL plakalar üzerine doğrudan sıvı kültür orta-log faz ve pipet büyüyebilir. Plakalar üzerinde gece boyunca bakteriler büyümek ve UV ışınlarına maruz çıkarmanıza izin verir. Ampisilin FUDR ile plakalar da ekarte edilmelidir. Canlı bakteri kullanmanın bir avantajı, solucanlar, bakteriyel gıda, canlı ve büyüyen bir bu yana yeni plakalar genellikle transfer yok ki. Canlı bakteri gıda dezavantaj OP50 C. patojen olduğunu elegans 3 Worms canlı bakteri yetişen potansiyel yaşlanma ile ilişkili ömrü fenotipleri maske UV-öldürülmüş bakteri, 3 yetişen solucanlar daha kısa bir canlı p var. Canlı bakteri Medyan yaşam süresi yaklaşık 20 gündür.

Gen RNAi tarafından yıkmak C ile kolayca gerçekleştirilebilir. devrildi gen karşılık gelen çift zincirli RNA üretir, böylece onların bakteriyel gıda değiştirerek elegans. İki RNAi bakteriyel kütüphanelerde mevcuttur C. açık okuma çerçeveleri kapağı daha az% 90 elegans genom 4-9 ömrü bağlamında RNAi yararlanmak için, ilgi RNAi klon OP50 bakterilerin değiştirin ve canlı bakteri ömrü ölçmek için önceki paragrafta anlatılan değişiklikleri izleyin. RNAi kütüphaneleri bir plazmid tabanlı ifade sistemi kullanın. Plazmid izopropil β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) tarafından uyarılan bir carbenicillin direnç kaset ve çift zincirli RNA ifade kullanmak için seçilir. Hem carbenicillin ve IPTG NGM plakaları dahil edilmesi gerekir. Plakaların her iki tip 100 ml NGM başına 100 mcL 1 M IPTG ve 50 mcL 50 mg / ml carbenicillin ekleyerek 1.4 adım değiştirin. Ampisilin carbenicillin aynı rolü yerine getirmesi bu yana, her iki tip plaka eklenecek gerekmez.

Diyet kısıtlaması, yaşlanmayı yavaşlatan evrimsel birbirinden farklı türler arasında en yaygın olarak çalışılan bir müdahaledir. C. katı ortam elegans, maksimum ömrü uzatma görülmektedir bakteriyel besin kaynağı yetişkinlik döneminde tamamen ortadan kalktığında, diyet kısıtlaması bir form bakteri yoksunluk (BD) olarak adlandırılır. BD bağlamında ömrü ölçmek için 9, 10, iki değişiklik yapma Yukarıdaki protokol. İlk olarak, üçüncü bir tip plaka hazırlar. Bu plakalar bakteriyel besin kaynağı eksik dışında Amp / FUDR plakaları aynı olmalıdır. İkinci adım, 3.2 ve adım 3.3 arasında ek bir adım Bölüm 3 değiştirin. Yetişkinlik 4. gününde (4 gün Amp / FUDR L4 larvaları aktarıldıktan sonra) transfer BD solucanlar Amp / FUDR plakaları bakteri eksik. Diyet kısıtlaması bu formu ile ilişkili bir komplikasyon solucanlar kaçmaya eğilim. Yokluğunda solucanlar gıda plakanın merkezine yakın kalmak olmaz, ama yiyecek arama keşif alan artacak. Sonuç olarak, solucanlar daha büyük bir bölümü, plaka ve birbirinden ayrılacak duvarları tarıyor. Biz genellikle hayvanların% 50 ila% 70 BD plakaları aktarıldıktan sonra kaçmaya bakın. Bu sorunu gidermek için, plakalar uçuş sonrası kalan önemli bir sayıda olması için birçok solucanlar gibi üç kez ile başlayın. BD ayrıca ek bir değişiklik ile herhangi bir ilave modifikasyonlar veya RNAi ile canlı bakteri gıda ile kombine edilebilir. RNAi BD, büyüyen ve istenmeyen bir besin kaynağı sağlayarak solucanlar transfer bakterileri önlemek için ek bir antibiyotik bakteri olmadan plakaları eklendi olmalıdır. Tetrasiklin ve kanamisin, 1.4 adım sırasında bakteriyel gıda olmadan FUDR plakaları eklenebilir ki bu da iki örnek. BD ömrü üzerinde anlamlı bir etkiye sahip, 2 gün yetişkinliğin veya yetişkinlik dönemi 14 gün kadar geç gibi erken başlanmalıdır. 10

Biz tartışacağız son değişiklik ek ilaçlar (örneğin ampisilin veya FUDR) olmadan NGM plakaları ömrünün ölçülmesidir. Bu yapılabilir4. adımı sırasında NGM ilaçlar ekleyerek ve Bölüm 3 ek bir adım ekleyerek. FUDR olmadan solucanlar Yumurtlama ve larva üretimi devam edecektir. Üreme faz (yaklaşık yetişkinliğin ilk haftasında) sırasında tüm deneysel solucanlar kendi çoluk onları ayırmak için her 2 günde bir, taze plakaları aktarılacak.

C. elegans öncelikle erkeklerde nadir rastlanılan hermaphroditic. Ömrü genelde sadece çift cinsiyetli ölçülür, aynı zamanda erkekler için ölçülebilir. Erkek C. ile çalışma ile ilişkili iki zorluklar vardır elegans. Hermafrodit kendini-gübreleme erkek yavrular çok küçük bir bölümünü (% 0.1) üretir ilk erkek solucanlar büyük bir miktar satın. 11 erkek solucanları içeren bir nüfus elde edildikten sonra, hermafrodit / erkek çiftleşme yaklaşık olarak eşit sayıda erkek ve solucanlar gibi sürece hermafroditlerde gıda varlığı korunur. Caenorhabditis Genetik Merkezi 12 Bay stokları sipariş veya görsel hermafrodit kendini-gübreleme üretilen kurucu erkekler için tarama tarafından oluşturulmuş olabilir. İkinci bir zorluk, erkek süpürücü bir davranıştır. Yiyecek ya da potansiyel arkadaşları (çift cinsiyetli) ya da yokluğunda, erkek solucanlar geniş bir hareket yelpazesi içeren bir arama davranış modu girin. Plakalar üzerinde 13 plaka duvarları kaçan solucanlar büyük bir kısmını bu davranışı sonuçları muhafaza ve kuruttuktan . Bu güçlükle başa çıkmak için genel bir yöntem çoğu kaçtı sonra önemli sayıda kalması yeterli erkek ile başlamak için basitçe.

Ömrü dışında, ortak bir yaşla ilişkili fenotip lipofusin birikimi. Lipofusin kompleks hücresel atık yaşla birlikte hücrelerinde birikir ve C ile yaşlanmanın bir biyolojik belirteç olarak kullanılır bozulmuş olamaz. elegans 14, 15 lipofusin fluoresces ve C ile kolayca görüntülenebilmekte DAPI kanal (Şekil 3) bir floresan mikroskop kullanılarak elegans. Lipofusin birikimi ömrü ile paralel olarak yararlı bir ikincil fenotipi toplanması için izin verirler, NGM plakalar üzerinde doğrudan ömrü için atılan solucanlar görüntülendi olabilir.

Ömrünün yanı sıra, bu makalede açıklanan protokol de C. yaşa bağlı felç fenotipik ilerlemesini puan kullanılır. proteotoxicity hastalığı elegans modelleri 16 bir solucan plaka üzerinde tarayamayabiliriz olur, ama yine de başını taşıyabilirsiniz felç olur. Bir solucan, dokunarak ya da platin transferi almak dürtüsüyle plaka yanıt NGM göre hareket etmek başarısız olursa, felç atılırsa, ama başını hareket eder. Genellikle ölür Worms en son canlı gözlem sırasında verildi felç puan (felç veya felç) saklayın. Daha da önemlisi, hatta vahşi tip C elegans ileri yaşı ile felç olur. Bu nedenle felci genellikle bu noktanın ötesinde yaklaşık 20 gün daha büyük solucanlar, gol için proteotoxicity hastalığın ilerlemesi nedeniyle normal yaşlanma ve felç nedeniyle felç ayırt etmek zorlaşır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma Gerontoloji Ödülü ve NIH Hibe MKGS 1R01AG031108-01, Ulusal Sağlık Enstitüsü, eğitim hibe P30AG013280 tarafından desteklenen bir Glenn / Afar buluşlar tarafından desteklenmiştir. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agar Reagent Fisher Scientific DF0145-17-0 (214530)
Ampicillin Reagent MidSci 0339
BactoTryptone Reagent Fisher Scientific DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone Reagent Fisher Scientific DF0118-17-0 (211677)
CaCl2 Reagent Fisher Scientific NC9699248 (1332-01)
Carbenicillin Reagent Gold Biotechnology C0109
Cholesterol Reagent Sigma-Aldrich C75209
Fluorodeoxyuridine (FUDR) Reagent Sigma-Aldrich F0503
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Reagent Gold Biotechnology I2481C5
KPi Dibasic Reagent Fisher Scientific 5087862 (3252-01)
KPi Monobasic Reagent Fisher Scientific 5087861 (3246-01)
MgSO4 Reagent Fisher Scientific NC9561800 (2500-01)
NaCl Reagent Fisher Scientific S251
Tris Reagent Sigma-Aldrich T1503
Yeast Extract Reagent Fisher Scientific DF0886-17-0 (288620)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).
  2. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes. Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).
  3. Garigan, D. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
  4. Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6, 525-523 (2007).
  5. Curran, S. P., Ruvkun, G. Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability. PLoS Genet. 3, e56-e56 (2007).
  6. Dillin, A. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  7. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
  8. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genet. 1, 119-128 (2005).
  9. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33, 40-48 (2003).
  10. Smith, E. D. Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans. BMC Dev Biol. 8, 49-49 (2008).
  11. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91, 67-94 (1979).
  12. Emmons, S. W., Sternberg, P. W. C. ELEGANS II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).
  13. Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24, 7427-7434 (2004).
  14. Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 21, 4089-4095 (1982).
  15. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  16. Steinkraus, K. A. Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7, 394-404 (2008).

Comments

4 Comments

  1. do dead c.elegans represent lipofuscin measurement?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2010 - 11:46 AM
  2. Please tell how to do life span experiments on Nano particle in respect of C.elegans.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2010 - 7:26 AM
  3. DŒs egg laying completely stop after adding FUdR in medium? Which worms (L1 or L² or L3 or L4) should be transfered to FUdR plate so the Egg laying not take place?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2010 - 8:12 AM
  4. The primary role of FUdR is to prevent egg hatching, not egg laying, though we typically see some reduction in egg production. FUdR will also interfere with cell division in the developing animal, so you have to wait until all of the somatic cell division is finished. Transfer the animals to FUdR at the L4 stage to prevent egg hatching without interfering with development.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2010 - 12:07 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics