沿海海水样品的过滤体积小(1 - 3L)

Biology

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Summary

此视频文件体积小(约1升)过滤的微生物生物量的水柱。

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1163, doi:10.3791/1163 (2009).

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Abstract

工作流程开始与下游微生物群落的沿海海域,养分和微量气体分析的集合。对于今天的示范样本收集从甲板HMS施德Saanich入口经营。此视频文件体积小(约1升)过滤的微生物生物量的水柱。该协议是延长大体积取样协议如前所述,一个主要的区别:在这里,有没有预过滤步骤,让所有大小类生物质收集到0.22微米的过滤器切断。样品收集这种方式,是理想的核酸分析。设置,过滤和清理的每个步骤需时约20-30分钟。如果同时使用两个蠕动泵,最多8个样品,同时可过滤。为了防止生物膜之间的采样人次的形成,所有的过滤设备,必须用稀盐酸和去离子水冲洗,高压灭菌后立即使用。

Protocol

  1. 设置过滤装置
    1. 过滤前,先擦去从满瓶凝露和权衡
    2. 将泵一侧的高压灭菌器斌,其他废物瓶。
    3. 然后将一个完整的样瓶,在蒸压斌;但是,不要删除瓶盖。
    4. 通过蠕动泵管,使油管露儿烧瓶中。
    5. 使用镊子,取出25毫升无菌吸管棉花,和吸管连接油管的另一端。
  2. 海水过滤
    1. 要开始过滤海水,打开瓶盖,插入吸管。打开泵和流动速度设置为1。观察,以确保水是被抽在正确的方向。
    2. 允许〜100毫升的水,穿过整个油管。
    3. 关闭泵和一个Sterivex过滤器附着在油管的自由端男性露儿装修。
    4. 继续筛选,直到没有水在瓶左。
  3. 储存过滤器
    1. 要存储的过滤器,首先驱逐任何剩余的水30-60毫升注射器。
    2. 用封口膜密封的Sterivex过滤器的底部。使用吸液管,添加1.8毫升裂解液过滤器,保持在后来试剂的过滤器〜200 UL空间。
    3. 然后,用小块的封口膜的Sterivex过滤器的顶部密封,标签的日期和样品标识过滤器。
    4. 商店标记的前50毫升猎鹰管过滤器在-80 ° C
  4. 清理
    1. 25毫升吸管插入含有0.1%的盐酸瓶,泵的切换。
    2. 盐酸清洗后,用灭菌水冲洗管路。

      最后,测量和记录现在空1L瓶的质量,以计算体积的水通过过滤器。

代表性的成果:每1升的水样产生一个Sterivix过滤器,其中包含生物质能大于0.22微米。这是存储在随后的DNA提取和分析裂解缓冲液。最终结果由一个Sterivix过滤裂解缓冲液中,每存储1升的瓶子,并准备提取DNA。该过滤器包含生物质能大于0​​.22微米。过滤器可以储存在-80 ° C之前的eDNA提取。

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Discussion

当务之急是盐水中删除任何挥之不去的痕迹,否则将腐蚀设备后,使用湿毛巾擦拭长椅和泵。虽然过程很简单,时间要求,可广泛取决于生物质的浓度或在被筛选的样本碎片。

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Acknowledgments

我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新,不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会(NSERC),加拿大的加拿大基金会。提高妇女地位司的支持由NSERC,Killam和图拉基金会资助的微生物多样性和进化中心奖学金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl For post-filtration rinse
Autoclaved water For post-filtration rinse

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Comments

2 Comments

  1. I'm interested about the video but unfortunately our school dŒs not have subscription for the JoVE. Is there any other way I can access the video?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 11, 2011 - 10:23 PM
  2. Dear Stephen, Please contact me at ward.parry@jove.com so that I can discuss your request with you. Best wishes,
    Ward Parry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2011 - 4:46 PM

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