Petit volume (1-3L) filtration d'échantillons d'eau de mer côtière

Biology

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Summary

Ce volume de documents vidéo de petite taille (~ 1 L) de la filtration de la biomasse microbienne de la colonne d'eau.

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1163, doi:10.3791/1163 (2009).

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Abstract

Le flux de travail commence avec la collecte des eaux marines côtières pour la communauté microbienne en aval, des analyses des éléments nutritifs et de gaz de trace. Pour les échantillons de la manifestation d'aujourd'hui s ont été recueillies dans le pont de l'exploitation du HMS John Strickland dans l'inlet Saanich. Ce volume de documents vidéo de petite taille (~ 1 L) de la filtration de la biomasse microbienne de la colonne d'eau. Le protocole est une extension du protocole de grand volume d'échantillonnage décrit précédemment, avec une différence majeure: ici, il n'ya aucune étape de pré-filtration, alors toutes les classes de taille de la biomasse sont collectées vers le 0,22 um de coupure du filtre. Les échantillons recueillis de cette façon sont idéales pour l'analyse des acides nucléiques. Étapes de la mise en place, la filtration et de nettoyage prennent chacun environ 20-30 minutes. Si vous utilisez deux pompes péristaltiques simultanément, jusqu'à 8 échantillons peuvent être filtrés dans le même temps. Pour prévenir la formation de biofilm entre les voyages d'échantillonnage, tous les équipements de filtration doit être rincée avec de l'HCl dilué et de l'eau déminéralisée et autoclavées immédiatement après usage.

Protocol

  1. Mise en place d'un appareil de filtration
    1. Avant de filtrage, d'abord essuyer la condensation de l'bouteilles pleines et les peser
    2. Placez un bac autoclave sur un côté de la pompe, et le ballon de déchets sur l'autre.
    3. Ensuite, placez une bouteille échantillon complet dans le bac à l'autoclave; cependant, ne pas enlever le bouchon de la bouteille encore.
    4. Passez le tube à travers la pompe péristaltique de telle sorte que l'embout Luer de la tubulure est dans le ballon.
    5. En utilisant une pince à épiler, retirez le coton à partir d'un stérile de 25 ml pipette, et joindre la pipette à l'autre extrémité du tube.
  2. Filtration de l'eau de mer
    1. Pour commencer le filtrage d'eau de mer, ouvert le flacon et insérer la pipette. Tournez sur la pompe et régler la vitesse d'écoulement à 1. Regarder pour s'assurer que l'eau est pompée dans la bonne direction.
    2. Autoriser ~ 100 ml d'eau de passer à travers le tube entier.
    3. Arrêtez la pompe et fixez un filtre Sterivex au raccord Luer mâle à l'extrémité libre de la tubulure.
    4. Continuez jusqu'à ce filtrage sans eau est laissé dans les bouteilles.
  3. Stockage des filtres
    1. Pour stocker les filtres, tout d'abord expulser toute l'eau restante avec une seringue 30-60 ml.
    2. Sceller le bas du filtre Sterivex avec du parafilm. Avec une pipette, ajouter 1,8 ml de tampon de lyse dans le filtre, en gardant ~ 200 ul d'espace dans le filtre pour plus tard des réactifs.
    3. Puis, sceller le dessus du filtre Sterivex avec un petit morceau de parafilm, et étiqueter les filtres avec la date et l'identification de l'échantillon.
    4. Stocker les filtres pré-étiquetés 50 tubes Falcon ml à -80 ° C
  4. Nettoyer
    1. Insérez la pipette 25 ml dans un flacon contenant 0,1% de HCl, et l'interrupteur sur la pompe.
    2. Après le lavage HCl, rincer la tubulure avec de l'eau en autoclave.

      Enfin, mesurer et enregistrer la masse de la bouteille maintenant vide 1L, afin de calculer le volume d'eau à travers le filtre.

Les résultats représentatifs: Chaque échantillon de 1 L d'eau donne une Sterivix filtre, qui contient de la biomasse supérieure à 0,22 um. Il est stocké dans un tampon de lyse pour l'extraction de l'ADN et l'analyse subséquente. Le résultat final se compose d'un filtre à Sterivix par bouteille d'1 litre stocké dans un tampon de lyse et prêt pour l'extraction de l'ADN. Le filtre contient biomasse supérieure à 0,22 um. Les filtres peuvent être conservés à -80 ° C avant l'extraction Edna.

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Discussion

Il est impératif d'essuyer les bancs et les pompes avec une serviette humide après utilisation afin d'éliminer toute trace persistante d'eau salée qui, autrement, se corrodent équipement. Bien que la procédure est simple, l'exigence de temps peut être étendue en fonction de la concentration de la biomasse ou de débris dans l'échantillon filtré.

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Acknowledgments

Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. DAW a été soutenu par des bourses du CRSNG, la Fondation Killam et TULA Centre a financé pour la diversité microbienne et évolution.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl For post-filtration rinse
Autoclaved water For post-filtration rinse

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Comments

2 Comments

  1. I'm interested about the video but unfortunately our school dŒs not have subscription for the JoVE. Is there any other way I can access the video?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 11, 2011 - 10:23 PM
  2. Dear Stephen, Please contact me at ward.parry@jove.com so that I can discuss your request with you. Best wishes,
    Ward Parry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2011 - 4:46 PM

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