Volumen pequeño (1-3L) Filtración de muestras de agua marina costera

Biology

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Summary

Este video documenta pequeño volumen (aproximadamente 1 L) de filtración de la biomasa microbiana de la columna de agua.

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1163, doi:10.3791/1163 (2009).

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Abstract

El flujo de trabajo comienza con la recolección de las aguas marinas costeras de la comunidad microbiana abajo, análisis de gases en nutrientes y oligoelementos. Para las muestras de la manifestación de hoy s se obtuvieron de la cubierta de la operación HMS John Strickland en Saanich Inlet. Este video documenta pequeño volumen (aproximadamente 1 L) de filtración de la biomasa microbiana de la columna de agua. El protocolo es una extensión del protocolo de muestreo a gran volumen se describió anteriormente, con una diferencia importante: aquí no hay paso de pre-filtración, por lo que todas las clases de tamaño de la biomasa se recogen hasta los 0,22 m de corte del filtro. Las muestras recogidas de esta manera son ideales para el análisis de ácidos nucleicos. Pasos de la instalación, filtración y limpieza de cada toma unos 20-30 minutos. Si se usan dos bombas peristálticas de forma simultánea, hasta 8 muestras pueden ser filtrados al mismo tiempo. Para prevenir la formación de biofilm entre los viajes de muestreo, todo el equipo de filtración debe ser enjuagado con HCl diluido y agua destilada y autoclave inmediatamente después del uso.

Protocol

  1. Puesta en marcha de aparatos de filtración
    1. Antes de filtrar, primero limpie la condensación de las botellas llenas y pesarlos
    2. Coloque una bandeja de autoclave en un lado de la bomba, y el frasco de residuos en el otro.
    3. A continuación, coloque una botella de muestra completa en la bandeja de autoclave, sin embargo, no quite la tapa de la botella todavía.
    4. Pase el tubo a través de la bomba peristáltica para que el extremo luer del tubo está en el frasco.
    5. Con unas pinzas, retirar el algodón de una pipeta estéril de 25 ml, y adjuntar la pipeta en el otro extremo de la tubería.
  2. Filtración de agua de mar
    1. Para empezar a filtrar el agua de mar, abrir la botella e insertar la pipeta. Encienda la bomba y ajustar la velocidad de flujo a 1. Reloj para asegurar que el agua se bombea en la dirección correcta.
    2. Permitir ~ 100 ml de agua pase a través del tubo entero.
    3. Apague la bomba y coloque un filtro Sterivex a la conexión luer macho en el extremo libre de la tubería.
    4. Continuar el filtrado hasta que no quede agua en las botellas.
  3. El almacenamiento de filtros
    1. Para almacenar los filtros, en primer lugar expulsar cualquier resto de agua con una jeringa de 30-60.
    2. Selle la parte inferior del filtro Sterivex con Parafilm. Con una pipeta, añadir 1,8 ml de solución amortiguadora de lisis del filtro, manteniendo ~ 200 ul de espacio en el filtro para la adición posterior de los reactivos.
    3. Luego, selle la parte superior del filtro Sterivex con un pequeño trozo de Parafilm, y la etiqueta de los filtros con la fecha y la identificación de la muestra.
    4. Almacenar los filtros de pre-etiquetados tubos Falcon de 50 ml a -80 ° C
  4. Limpiar
    1. Inserte la pipeta de 25 ml en un matraz que contenía 0,1% de HCl, y el interruptor de la bomba.
    2. Después del lavado HCl, enjuague el tubo con agua esterilizada.

      Por último, medir y registrar la masa de las botellas de 1 litro vacía con el fin de calcular el volumen de agua que pasa por el filtro.

Resultados representante: Cada muestra de agua de 1 L rinde un Sterivix filtro, que contiene la biomasa mayor de 0,22 micras. Esto se almacena en buffer de lisis para la extracción de ADN y posterior análisis. El resultado final consiste en un filtro de Sterivix por botella de 1 litro almacenados en buffer de lisis y listo para la extracción de ADN. El filtro contiene la biomasa mayor de 0,22 micras. Los filtros pueden ser almacenadas a -80 ° C antes de la extracción Edna.

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Discussion

Es imprescindible para limpiar los bancos y las bombas con una toalla húmeda después de cada uso para eliminar cualquier rastro persistente de agua salada que de otra manera corroer el equipo. Aunque el procedimiento es simple, el tiempo requerido puede ser extensa en función de la concentración de la biomasa o los residuos de la muestra que se filtra.

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Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. DAW fue apoyado por becas de NSERC, Killam y la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl For post-filtration rinse
Autoclaved water For post-filtration rinse

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Comments

2 Comments

  1. I'm interested about the video but unfortunately our school dŒs not have subscription for the JoVE. Is there any other way I can access the video?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 11, 2011 - 10:23 PM
  2. Dear Stephen, Please contact me at ward.parry@jove.com so that I can discuss your request with you. Best wishes,
    Ward Parry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2011 - 4:46 PM

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