استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر Sterivex فلاتر والسيزيوم كلوريد التدرج الكثافة الطرد المركزي

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Summary

نحن تصف طريقة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي الجينومية من الكتلة الحيوية العوالق ركزت على 0.22 ميكرون Sterivex المرشحات ، تليها السيزيوم كلوريد كثافة الطرد المركزي لتنقية الانحدار.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (31), e1352, doi:10.3791/1352 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتستخدم هذه الطريقة لاستخراج عالية الجينومية الوزن الجزيئي من الحمض النووي من الكتلة الحيوية العوالق ركزت على 0.22 ميكرومتر Sterivex الفلاتر التي تم التعامل مع تخزين / تحلل العازلة والمؤرشفة في -80 درجة مئوية ، وتطهير هذا الحمض النووي باستخدام كثافة كلوريد السيزيوم التدرج. بروتوكول تبدأ مع اثنين من الخطوات الحضانة لمدة ساعة لتحرير الحمض النووي من الخلايا وإزالة الحمض النووي الريبي. المقبل ، سلسلة من الفينول : يتم تنفيذ عمليات الاستخراج وأعقب الكلوروفورم الكلوروفورم بواسطة الطرد المركزي لإزالة البروتينات ومكونات غشاء الخلية ، وجمع من استخراج الحمض النووي مائي ، وعدة خطوات تبادل العازلة لغسل وتركيز استخراجها. الجزء الخامس يصف تنقية كلوريد السيزيوم اختياري عبر التدرج الكثافة. فمن المستحسن للعمل مع أقل من 15 عينة في وقت واحد لتجنب الارتباك وخفض الوقت البروتوكول. إجمالي الوقت اللازم لهذا البروتوكول يعتمد على عدد من العينات ليكون استخراجه. عينات لمدة 10-15 وعلى افتراض معدات الطرد المركزي الصحيح هو متاح ، وينبغي أن تأخذ هذا البروتوكول بأكمله 3 أيام. تأكد من أن يكون لديك مجموعة أفران التهجين إلى درجة الحرارة في بداية العملية.

Protocol

ملاحظة : جميع aliquoted الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول من أسهم معمل إلى أصغر عامل المخزونات هذا مهم جدا لتجنب التلوث عبر عينات من الحمض النووي الخاص من وتلوث مخزونات المختبر. أيضا ، عندما pipetting ، تأكد من تغيير ماصة نصائح لكل بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل.

الجزء الأول : تحلل الخلايا والهضم

  1. يبدأ هذا البروتوكول من قبل ذوبان Sterivex المرشحات التي تحتوي على تركيز من قبل الكتلة الحيوية العوالق على الجليد. عن البساطة ، ونحن هنا وصف الإجراء لمعالجة عامل تصفية الفردية. في الممارسة العملية ، نوصي 16 أو أقل تجهيز المرشحات في وقت واحد.
  2. بمجرد أن المرشح قد تحسنت ، وتبدأ في أول اثنين من حضانات : ليز واحد إلى الخلايا وإزالة الحمض النووي الريبي ، واحد لتحطيم البروتينات. لحضانة الأولى ، إضافة 100 الليزوزيم ميكرولتر (125 ملغ في 1000 TE ميكرولتر) و 20 مل ريبونوكلياز A (10 ميكروغرام / مل) إلى التصفية. ختم التصفية مع Parafilm وترك الأمر للتدوير في الفرن التهجين عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. لحضانة المقبل ، إضافة بروتين ميكرولتر 100 K و 100 ميكرولتر SDS 20 ٪ للمرشح. ختم به Parafilm وترك الأمر لتدوير 1-2 ساعات أكثر في الفرن التهجين ، وهذه المرة على 55 درجة مئوية.
  4. استخدام حقنة 5cc ، نقل lysate من تصفية Sterivex في أنبوب 15 مل فالكون. شطف تصفية مع 1 مل العازلة تحلل وإضافة إلى شطف السائل في أنبوب lysate فالكون الخاص باستخدام المحاقن 5cc. الآن أن لديك lysed وهضمها الخلايا الخاصة بك ، وأنت على استعداد لاستخراج عينات من الحمض النووي.

الجزء الثاني : استخراج الحمض النووي

  1. الخطوة التالية هي استخدام الأسلوب الفينول كلوروفورم ، لاستخراج الحمض النووي من lysate الخاص. إضافة حجم مساو (حوالي 3ml) من الفينول : الكلوروفورم : كحول أيزو أميلي (IAA) في أنبوب lysate ، مع التأكد من تغير نصائح ماصة لكل بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل. دوامة لمدة 10 ثانية لمزيج جيد.
  2. تدور في أنبوب 2500 غرام لمدة 5 دقائق ، والتأكد من أجهزة الطرد المركزي غير متوازنة. أثناء الطرد المركزي ، ينبغي أن مزيج الفينول كلوروفورم lysate منفصلة في طبقتين : طبقة العضوية التي تحتوي على الفينول ، وكلوروفورم ، والبروتينات من عينة الخاص بك ، في القاع ، وطبقة مائية ، والتي تتكون من الحمض النووي الخاص ، والمياه ، وغيرها مزيد من جزيئات ماء ، في الأعلى.
  3. نقل الطبقة المائية (التي تحتوي على الحمض النووي الخاص) في أنبوب جديد 15 مل فالكون. يجب الحرص على عدم لمس واجهة مع طرف ماصة (اترك دائما كمية صغيرة من طبقة وراء مائي).
  4. لهذا الأنبوب الجديد ، إضافة حجم مساو (تقريبا 3mL) من الكلوروفورم : IAA ، مع التأكد من تغير نصائح ماصة لكل بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل. دوامة لمدة 10 ثانية. هذه الخطوة تساعد على إزالة أي الفينول المتبقية من عينة الحمض النووي الخاص.
  5. تدور في 2500 غرام لمدة 5 دقائق أو حتى طبقة مائية واضحة. نقل مائي في طبقة جديدة ، وصفت وأنبوب فالكون إضافة 1 مل من TE عند pH 8.0 ، والحرص على عدم لمس واجهة مع طرف ماصة (اترك دائما كمية صغيرة من طبقة وراء مائي). هذه الطبقة المائية يحتوي على استخراج الحمض النووي الخاص.

الجزء الثالث : تركيز الحمض النووي والغسل

  1. والخطوة التالية هي أن يغسل والتركيز على عينة من الحمض النووي في أنبوب 15 مل Amicon الترا الطرد المركزي. أنابيب Amicon تتكون من جزيئات التصفية التي يحتفظ عند أو فوق وزن جزيئي محدد (retentate) وأنبوب للقبض على التدفق من خلال (الراشح). في هذه الحالة ، يحتفظ تصفية الحمض النووي الخاص بك (retentate). نقل استخراج الحمض النووي الخاص من الخطوة 2.5 إلى المقصورة مرشح من أنبوب Amicon الترا.
  2. تدور ز 3500 لمدة 10 دقائق. تحقق للتأكد من وجود أقل من 1 مل من السائل المحتفظ به في تصفية Amicon. إذا كان لا يزال أكثر retentate ، الملء التصفية مع الشركة المصرية للاتصالات وتدور مرة أخرى. تأكد من استخدام معلومات سرية جديدة ماصة لكل TE بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل.
  3. إزالة التدفق من خلال ، أو الترشيح ، الى آخر أنبوب فالكون وحفظه في الثلاجة حتى يكون لديك الحمض النووي أكد المنتج النهائي على هلام (الجزء الرابع).
  4. إضافة 2 مل العازلة TE إلى تصفية Amicon وتدور عند 3500 ز لمدة 6 دقائق ، مع التأكد من استخدام غيض ماصة جديدة لكل TE بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل. مع ذلك بركة الراشح من الخطوة 3.3 وحفظها في البراد.
  5. غسل الحمض النووي أكثر مرتين مع الشركة المصرية للاتصالات عن ما مجموعه ثلاثة يغسل (مع التأكد من استخدام دائما غيض ماصة الطازجة) ، وإنقاذ الترشيح في كل مرة (كما في الخطوات 3.3 و 3.4). لغسل الماضي ، وتدور حتى 200-500 مل من retentate يبقى في تصفية Amicon. سجل الحجم النهائي ونقل retentate (التي تحتوي على الحمض النووي الخاص) إلى أنبوب إيبندورف المسمى 1.5 مل.

الجزء الرابع : تحديد الحمض النووي للجودة

  1. فحص الحمض النووي للجودة وتقدير تركيز الحمض النووي التي ينفد العينات الخاصة بك على 0.8 ٪ هلام هلام ستا agaroseINED مع 1ml إيثيديوم بروميد (EtBr) بين عشية وضحاها. (كن حذرا للغاية عند استخدام EtBr ، بل هو معروف ومسرطن مطفر المشتبه بهم. تأكد من تغيير القفازات في كثير من الأحيان ، وتجنب نقل EtBr إلى بقية المختبر والجلد). تحميل عينات الحمض النووي بجانب السلالم ، والتي تكون بمثابة حجم وكثافة المعايير (راجع الخطوة التالية).
  2. في الممرات القليلة الأولى ، تحميل سلالم مع عصابات من مختلف الأوزان الجزيئية وتركيزات. نوصي نمط التحميل التالية : في الممرات الأول والأخير (حارات الأبعد) ، تحميل 10 ميكرولتر من 50ng/μl من 1KB + أو 2log سلم. في الممرات 2،3 و 4 ، تحميل ميكرولتر 2 ، ميكرولتر 5 و 10 ميكرولتر ، على التوالي ، من سلم λHindIII 50ng/μl. أخيرا ، تحميل 5 ميكرولتر في حارة من استخراج الحمض النووي مع صبغة لكل عينة.
  3. تشغيل هلام في 15 فولت لحوالي 16 ساعة (ونحن ننصح بتشغيل بين عشية وضحاها).
  4. في اليوم التالي ، الصورة الجل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية هلام وثائق النظام. لتحديد نطاق الوزن الجزيئي للحمض النووي الخاص وتركيزها ، مقارنة العصابات عينة لعصابات من سلالم. نوعية جيدة وسوف يكون الحمض النووي الوزن الجزيئي عالية (> 36kb) ، وتظهر دلائل تذكر على القص / التدهور. انظر الشكل 1.

الجزء الخامس : التدرج كلوريد السيزيوم الطرد المركزي

  1. إذا كانت نوعية الحمض النووي هو جيد وكمية غير كافية ، يمكنك المضي قدما لتنقية الحمض النووي عن طريق إجراء كلوريد السيزيوم (CSCL) الطرد المركزي التدرج. علما أن هذه الخطوة اختيارية لتنقية وليس من الضروري لجميع التطبيقات المصب (على سبيل المثال ، إذا كنت تريد إنشاء مكتبات fosmid لك يجب تنقية ، في حين إذا كنت تريد ببساطة لإجراء تفاعلات PCR ، وتنقية وليس من الضروري عادة). أولا ، تسمية أنبوب واحد لأجهزة الطرد المركزي كل عينة.
  2. لكل أنبوب الطرد المركزي ، إضافة 160 ملغ من CSCL ، 178 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني. بعد إضافة CSCL والحمض النووي للأنبوب ، ووضع قطعة صغيرة من parafilm على رأس الأنبوب والأنبوب برفق عكس 1-20 مرات من أجل خلط المكونات. لا تخلط بواسطة pipetting ، مما قد يتسبب في القص من الحمض النووي. المقبل ، إضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / EtBr ميكرولتر لهذا الأنبوب ومزجها في نفس الطريق. (كن حذرا للغاية عند استخدام EtBr ، بل هو معروف ومسرطن مطفر المشتبه بهم. تأكد من تغيير القفازات في كثير من الأحيان ، وتجنب نقل EtBr إلى بقية المختبر والجلد).
  3. تأكد من أن تكون متوازنة وزن أنابيب الطرد المركزي قبل كل هذا أن الاختلافات بين وزن الأنابيب هي أقل من 1 ملغ.
  4. وضع أنابيب في مرقئ الدوار به ، أغلق الغطاء ووضع الدوار داخل نابذة فائقة السرعة.
  5. إغلاق الباب نابذة فائقة السرعة. وسيتم تطبيق فراغ بمجرد إغلاق الباب. بين عشية وضحاها في تشغيل 100000 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة و 20 درجة مئوية.
  6. عند اكتمال الطرد المركزي ، واخراج الأنابيب من الدوار باستخدام مرقئ ووضع على الرف الأنبوب.
  7. تصور الحمض النووي مع transilluminator الضوء الأزرق ، أو إذا كان غير متوفر ، واستخدام الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة ، في غرفة مظلمة. ارتداء زوج من النظارات تصفية العنبر لرؤية الفرقة الحمض النووي. انظر الشكل 2.
  8. باستخدام محقنة معقمة وإبرة 1cc (26G 5 / 8) ، وإزالة الفرقة الحمض النووي ووضعه في أنبوب إيبندورف 1.5ml.
  9. للمساعدة في استرداد معظم الحمض النووي المحاصرين في الفضاء بالرصاص في المحاقن ، وشطف المحاقن مع الشركة المصرية للاتصالات 100 ميكرولتر وإضافة محلول شطف للأنبوب. يعد أنبوب واحد مع 100 العازلة TE ميكرولتر لكل عينة من أجل منع التلوث المتبادل.
  10. لإزالة EtBr من الحمض النووي ، إضافة حجم مساو من الماء المشبع بيوتانول إلى أنبوب ، وعكس أنابيب بلطف 1-20 مرات ، الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة وتجاهل الطبقة العليا.
  11. تكرار الغسيل حتى لون شفاف بيوتانول ، 3 -- 4 مرات أكثر.
  12. مكان TE 4 مل في أنبوب الطرد المركزي Amicon الترا وإضافة محلول الحمض النووي من أعلاه.
  13. الطرد المركزي عند 3500 غرام عند درجة حرارة الغرفة ، حتى يتم خفض حجم الحمض النووي لنحو 100-500 ميكرولتر (حوالي 6-7 دقائق) وتجاهل تدفق من خلاله.
  14. إضافة 2ml TE لتصفية Amicon وأجهزة الطرد المركزي عند 3500 ز لمدة 6 دقائق ، مع التأكد من استخدام غيض ماصة جديدة لكل بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل. كرر مرتين.
  15. تركز على الحجم النهائي من 5-10 ميكرولتر بواسطة الطرد المركزي إضافية حسب الضرورة ، والحل نقل الحمض النووي على فلتر لأنبوب جديد 1.5 مل إيبندورف.
  16. إضافة TE 40 ميكرولتر إلى تصفية Amicon وماصة صعودا ونزولا على طول كل من الأغشية تصفية لتغسل أي الحمض النووي المتبقية. إضافة إلى هذا الحل في أنبوب 5.15.
  17. مكان YM - 30 وحدة تصفية Microcon في أنبوب Microcon وprewash في Microcon بإضافة 200 المياه وتعقيمها ميكرولتر الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق.
  18. إضافة محلول الحمض النووي من 5.16 إلى Microcon prewashed من اجل التركيز على مزيد من الحمض النووي. الطرد المركزي في 5000-10000 ز : 1 -- 3 دقيقة. تحقق من كمية السائلعلى الطرد المركزي فلتر وكرر حتى يتم تقليل كمية السائل على تصفية ما يقرب من 50 ميكرولتر.
  19. مكان وحدة تصفية رأسا على عقب في أنبوب Microcon جديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 ز لمدة 3 دقائق. كمية مثالية من محلول مركز من 50-60 ميكرولتر.
  20. وسجل قياس تركيز على الحمض النووي والتحقق من جودة Nanodrop الذروة (ينبغي 260nm).
  21. قسامة نقل صغيرة من الحمض النووي لأنبوب إيبندورف نظيفة للعمل على تجميد الأرصدة وناقص 20. نقل بقية الحمض النووي لإيبندورف نظيفة في الثانية ، وتجميد ناقص 80.

ممثل النتائج :

عندما يتم هذا البروتوكول بشكل صحيح ، يجب أن تشاهد صورة هلام بعد الخطوة 4.4 في تحديد الحمض النووي مماثلة لجودة الشكل 1. وسوف الفعلية تركيز الحمض النووي من مقتطفات تختلف تبعا لمصدر العينة. بعد الخطوة الطرد المركزي 5.7 في مدروج CsCl ، ينبغي أن الحمض النووي الجيني مضيئة من الضوء الأزرق مشابها الشكل 2.

الشكل 1
الشكل 1. 0.8 ٪ هلام إستشراد agarose صورة عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي التي تم جمعها من أربعة في أعماق المحيط الهادي المناطق شبه القطبية (في نسختين) ، ملطخة بروميد كيل إيثيديوم الإقحام (10 ملغ / مل). تم تشغيل الجل في ل15V ~ 16hrs في 1X TBE هلام العازلة على التوالي. عينة العصابات هي من نوعية جيدة تظهر دلائل تذكر على القص الميكانيكية (عرض شرائح واحد أو مسحات مقابل نطاقات متعددة) على الرغم من أن الاحتفاظ ببعض المقتطفات 10M تحمل أكثر من الحمض النووي الريبي (انظر اللطاخة في الكيلوبايت 0،5-2،0).

الشكل 2
الشكل 2. الجينوم الفرقة DNA تنيره الضوء الأزرق بعد الطرد المركزي مدروج CsCl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اعتمادا على عدد العينات التي سيتم تجهيزها ، وهذا يمكن أن يكون الإجراء الوقت كثيفة بسبب خطوتين الحضانة لمدة ساعة ، ويغسل وتتكرر الخطوات الطرد المركزي. فمن الأفضل أن خطة يومين كله لهذا الإجراء لترك متسع من الوقت. إذا كانت هناك مشاكل في الحصول على حجم استخراج النهائي في أنبوب Amicon للحد من أسفل إلى 500μl - 200 خلال تركيز الحمض النووي والغسيل ، ومحاولة القيام إضافية يغسل TE وcentrifugations (اكرر الجزء الثالث) وحتى حجم المناسبة متبقية. أيضا ، إذا كان استخراج الروائح الشديدة من كلوروفورم ، فمن الأفضل أن لا يغسل اضافية حتى يقلل رائحة للتأكد من إزالة كافة الكلوروفورم. مرة أخرى ، يتم aliquoted جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول من أسهم معمل إلى أصغر عامل المخزونات هذا مهم جدا لتجنب التلوث عبر عينات من الحمض النووي الخاص من وتلوث مخزونات المختبر. أيضا ، عندما pipetting ، تأكد من تغيير ماصة نصائح لكل بالإضافة إلى تجنب التلوث المتبادل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. كان مدعوما من قبل JJW زمالات من NSERC وشعبة النهوض بالمرأة كان مدعوما من الزمالات NSERC ، Killam ومؤسسة التمويل مركز تولا للتنوع وتطور الميكروبية. كان مدعوما من قبل المركز SL تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 cc syringe (26G5/8 needle) BD Biosciences 309597
1 ml syringe (26G5/8 needle) BD Biosciences 309597
1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
15ml tubes Sigma-Aldrich CLS430791
5cc syringe BD Biosciences 309603
Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices EMD Millipore UFC801096 10,000 Nominal molecular weight limit
Butanol Fisher Scientific A383-1 Make it water saturated (butanol:water = 1:1)
Centrifuge rotor, JA5.3 Beckman Coulter Inc. 368690
Centrifuge, Avanti® J-E Beckman Coulter Inc. 369003
Cesium chloride Sigma-Aldrich C4036
Chloroform:IAA (24:1) Sigma-Aldrich 25666-500ML
Ethidium Bromide (EtBr) Sigma-Aldrich E1510-10ml
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Hybridization oven Fisher Scientific 13-247-10 37°C & 55°C
Lysis Buffer 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-5G 125 mg in 1000 μl TE
Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410 50 bp cut off
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) Sigma-Aldrich 77617-500ML
Proteinase K Qiagen 19133
RNase A Fisher Scientific BP2539-100 10 μg/ml
Safe Imager™ Blue light transilluminator Invitrogen S37102
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4509 20% SDS
Sterivex filters Fisher Scientific SVG010RS
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Table top centrifuge Eppendorf 5415D
TE buffer, pH 8.0
Trizma® base Sigma-Aldrich T1503
Ultracentrifuge rotor, TLA 100 Beckman Coulter Inc. 343847
Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) Beckman Coulter Inc. 343775
Ultracentrifuge tube rack Beckman Coulter Inc. 348302
Ultracentrifuge, Optima® Max Beckman Coulter Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15, (3), 187-190 (2004).
  2. Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2, (5), 516-529 (2000).
  3. DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178, (3), 591-599 (1996).
  5. Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55, (3), 548-554 (1989).

Erratum

Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

The step was corrected from:

Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.

to:

Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.

Comments

1 Comment

  1. I am happy to see your method using the sterivex filter, but a little surprised that the references do not include this one: Somerville, C.C., I.T. Knight, W.L. Straube, and R.R. Colwell. 1989. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55: 548-554.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 21, 2010 - 9:20 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics