0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फ़िल्टर और सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल centrifugation से डीएनए निष्कर्षण

Biology

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ERRATUM NOTICE

Summary

हम उच्च planktonic बायोमास से आणविक भार जीनोमिक डीएनए 0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फिल्टर, सीज़ियम शुद्धि के लिए क्लोराइड घनत्व ढाल centrifugation द्वारा पीछा किया पर ध्यान केंद्रित की निकासी के लिए एक विधि का वर्णन.

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Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (31), e1352, doi:10.3791/1352 (2009).

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Abstract

इस विधि planktonic 0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फिल्टर है कि भंडारण / lysis बफर के साथ इलाज किया गया है और -80 ° सी में संग्रहीत पर केंद्रित बायोमास से उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, और यह एक सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल का उपयोग डीएनए शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल दो एक घंटे ऊष्मायन कदम के कोशिकाओं से डीएनए आजाद कराने और आरएनए हटायें के साथ शुरू होता है. अगला, Phenol की एक श्रृंखला: क्लोरोफॉर्म और क्लोरोफॉर्म extractions centrifugation द्वारा प्रदर्शन का पालन कर रहे हैं प्रोटीन और कोशिका झिल्ली घटकों, जलीय डीएनए निकालने के संग्रह, और कई बफर विनिमय कदम को धोने और ध्यान केंद्रित निकालने निकालना. भाग पांच सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल के माध्यम से वैकल्पिक शुद्धि का वर्णन करता है. यह एक समय में कम से कम 15 नमूनों के साथ काम करने के लिए भ्रम से बचने और नीचे प्रोटोकॉल समय में कटौती की सिफारिश की है. कुल इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समय निकाला जा नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है. 3 दिन, 10-15 नमूने और यह सोचते हैं उचित centrifugation उपकरण उपलब्ध है के लिए इस पूरे प्रोटोकॉल लेना चाहिए. सुनिश्चित करें कि आप संकरण प्रक्रिया के शुरू में तापमान करने के लिए सेट ओवन है.

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता अभिकर्मकों प्रयोगशाला स्टॉक से छोटे काम कर रहे शेयरों यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए अपने डीएनए के नमूने और प्रयोगशाला शेयरों के संदूषण के पार संक्रमण से बचने में aliquoted हैं. इसके अलावा, जब pipetting, हर पार संक्रमण से बचने के लिए इसके अलावा करने के लिए विंदुक युक्तियाँ बदलने के लिए सुनिश्चित करें.

भाग एक: सेल lysis और पाचन

  1. इस प्रोटोकॉल Sterivex फिल्टर है कि बर्फ पर पहले ध्यान केंद्रित planktonic बायोमास होते विगलन द्वारा शुरू करो. सादगी के लिए, यहाँ हम एक व्यक्ति फिल्टर के प्रसंस्करण के लिए प्रक्रिया का वर्णन. अभ्यास में, हम एक समय में 16 प्रसंस्करण या कम फिल्टर सलाह देते हैं.
  2. एक बार फिल्टर thawed है, दो incubations के पहले शुरू: एक कोशिकाओं lyse और शाही सेना, और एक को दूर करने के लिए नीचे प्रोटीन को तोड़ने. पहली ऊष्मायन के लिए, फिल्टर करने के लिए 100 μl lysozyme (1000 μl ते में 125 मिलीग्राम) और 20 मिली RNase (10 μg / मिलीलीटर) जोड़ें. Parafilm साथ फिल्टर reseal और यह संकरण ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए बारी बारी से करने के लिए छोड़.
  3. अगले ऊष्मायन के लिए, फिल्टर करने के लिए 100 μl proteinase कश्मीर और 100 μl 20% एसडीएस जोड़ें. Reseal Parafilm का उपयोग कर छोड़ संकरण ओवन में एक से दो घंटे अधिक बारी बारी से करने के लिए, 55 में इस समय डिग्री सेल्सियस
  4. 5cc सिरिंज का प्रयोग, Sterivex फिल्टर से एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में lysate हस्तांतरण. 1 मिलीलीटर lysis बफर के साथ फिल्टर कुल्ला और जोड़ने अपने फाल्कन ट्यूब में lysate 5cc सिरिंज का उपयोग करने के लिए तरल कुल्ला. अब है कि आप और lysed आपके कोशिकाओं पचा, आप उनके डीएनए निकालने के लिए तैयार हैं.

भाग दो: डीएनए निष्कर्षण

  1. अगले कदम के phenol के क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग अपने lysate से डीएनए निकालने है. Lysate ट्यूब Isoamyl शराब (IAA), इसके अलावा एक के लिए विंदुक युक्तियाँ बदलने के लिए पार संक्रमण से बचने के लिए सुनिश्चित करें: क्लोरोफॉर्म: Phenol के एक समान (3ml के बारे में) की मात्रा बनाने में जोड़ें. मिश्रण अच्छी तरह से 10 सेकंड के लिए भंवर.
  2. 5 मिनट के लिए 2500 ग्राम पर ट्यूब स्पिन, सुनिश्चित करें कि अपकेंद्रित्र संतुलित है. Centrifugation के दौरान, phenol के क्लोरोफॉर्म - lysate मिश्रण दो परतों में अलग होना चाहिए: अपने नमूना से एक कार्बनिक phenol, क्लोरोफॉर्म, और प्रोटीन युक्त तल पर, परत, और एक जलीय परत है, जो अपने डीएनए, पानी के होते हैं, और अन्य शीर्ष पर और अधिक हाइड्रोफिलिक अणु,.
  3. एक नया 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में जलीय परत (अपने डीएनए युक्त) स्थानांतरण. विंदुक टिप (हमेशा जलीय परत के पीछे एक छोटी राशि छोड़) के साथ अंतरफलक छू नहीं सावधान रहो.
  4. इस नए ट्यूब करने के लिए, क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा (लगभग 3ml) जोड़ें: IAA, विंदुक युक्तियाँ इसके अलावा एक के लिए बदलने के लिए पार संक्रमण से बचने के लिए सुनिश्चित करें. 10 सेकंड के लिए भंवर. इस कदम के लिए अपने डीएनए नमूने से किसी भी शेष phenol हटाने में मदद करता है.
  5. 5 मिनट के लिए या जब तक जलीय परत स्पष्ट है जी 2500 में स्पिन. एक नया लेबल फाल्कन ट्यूब में जलीय परत स्थानांतरण और 8.0 पीएच पर ते की एक मिलीलीटर जोड़ने, पिपेट टिप (हमेशा जलीय परत के पीछे एक छोटी राशि छोड़) के साथ अंतरफलक छू नहीं सावधान किया जा रहा है. यह जलीय परत अपने डीएनए निकालने शामिल हैं.

भाग तीन: डीएनए एकाग्रता और धुलाई

  1. अगले कदम को धोने और एक 15 मिलीलीटर Amicon अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूब में डीएनए नमूने केंद्रित है. Amicon ट्यूबों एक फिल्टर है कि या एक निर्दिष्ट आणविक वजन (retentate) और एक ट्यूब के ऊपर के माध्यम से प्रवाह पकड़ (निथारना) अणुओं को बरकरार रखे हुए से मिलकर बनता है. इस मामले में, फिल्टर अपने डीएनए (retentate) बरकरार रखती है. 2.5 कदम से एक Amicon अल्ट्रा ट्यूब के फिल्टर डिब्बे के लिए अपने डीएनए निकालने स्थानांतरण.
  2. 10 मिनट के लिए 3500 ग्राम में स्पिन. यकीन है कि वहाँ Amicon फिल्टर में बनाए रखा तरल के कम से कम 1 मिलीलीटर है की जाँच करें. यदि अधिक retentate बनी हुई है, फिल्टर ते के साथ फिर से भरना और फिर स्पिन. हर ते इसके अलावा के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए पार संक्रमण से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. प्रवाह के माध्यम से, छानना या निकालें, दूसरा फाल्कन ट्यूब और इसे फ्रिज में बचा है जब तक आप एक जेल पर अपने अंतिम डीएनए उत्पाद की पुष्टि की है (भाग चार).
  4. Amicon फिल्टर 2 मिलीलीटर ते बफर जोड़ें और 6 मिनट के लिए 3500 ग्राम पर स्पिन, प्रत्येक ते अलावा के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए पार संक्रमण से बचने के लिए सुनिश्चित करें. 3.3 कदम से के साथ पूल छानना और फ्रिज में बचाने के लिए.
  5. ते के साथ तीन washes (हमेशा एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग सुनिश्चित करने के) की कुल के लिए दो बार अधिक डीएनए धो, छानना और हर समय की बचत (प्रति 3.3 और 3.4 कदम के रूप में). पिछले धोने के लिए, स्पिन Amicon फिल्टर में retentate बनी हुई है की 200 से 500 मिलीलीटर तक. अंतिम मात्रा रिकॉर्ड और retentate एक लेबल 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब (अपने डीएनए युक्त) हस्तांतरण.

भाग चार: डीएनए गुणवत्ता का निर्धारण

  1. डीएनए गुणवत्ता की जाँच करें और बाहर एक जेल 0.8% agarose जेल स्टेशन पर अपने नमूनों चलाकर डीएनए की एकाग्रता का अनुमान1ml ethidium (EtBr) रातोंरात ब्रोमाइड के साथ ined है. (बेहद सतर्क रहो, जब का उपयोग EtBr दस्ताने अक्सर बदलने के लिए और प्रयोगशाला के आराम करने के लिए और आपकी त्वचा के लिए EtBr हस्तांतरण से बचने के लिए सुनिश्चित करें कि यह एक ज्ञात उत्परिवर्तजन और संदिग्ध कैसरजन है.) डीएनए सीढ़ी के पास नमूने, जो के रूप में सेवा करते हैं लोड आकार और तीव्रता मानकों (अगले कदम देखें).
  2. पहले कई गलियों में, विभिन्न आणविक भार और सांद्रता के बैंड के साथ सीढ़ी लोड. पहली और आखिरी गलियों में (बाह्यतम गलियों), लोड 1kb 50ng/μl के 10 μl + या 2log सीढ़ी: हम निम्नलिखित लोडिंग पैटर्न की सिफारिश. 2,3 और 4 गलियों, लोड 2 μl, 5 μl, और 10 μl 50ng/μl λHindIII सीढ़ी के क्रमशः में. अंत में, प्रत्येक नमूने के लिए रंग के साथ डीएनए निकालने के प्रति लेन 5 μl लोड.
  3. लगभग 16 घंटे के लिए 15 वोल्ट (हम रातोंरात चलाने का सुझाव) में जेल चलाएँ.
  4. अगले दिन, एक यूवी जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग करते हुए जेल तस्वीर. अपने डीएनए और अपनी एकाग्रता के आणविक वजन सीमा निर्धारित करने के लिए, सीढ़ी के बैंड के लिए नमूना बैंड की तुलना करें. अच्छी गुणवत्ता डीएनए उच्च आणविक भार (36KB>) है, और बाल काटना / गिरावट के कुछ सबूत दिखाने. चित्रा 1 देखें.

पांच: भाग सीज़ियम क्लोराइड ढाल centrifugation

  1. यदि डीएनए गुणवत्ता अच्छी है और मात्रा पर्याप्त है, तो आप सीज़ियम (CSCL) क्लोराइड ढाल centrifugation प्रदर्शन से डीएनए शुद्ध आगे बढ़ सकते हैं. नोट है कि इस शुद्धि कदम वैकल्पिक है और सभी बहाव के अनुप्रयोगों (उदाहरण के लिए, यदि आप fosmid पुस्तकालयों तुम शुद्ध चाहिए उत्पन्न, अगर आप बस के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करना चाहते हैं, जबकि शुद्धि आम तौर पर आवश्यक नहीं है चाहते हैं) के लिए आवश्यक नहीं है. सबसे पहले, प्रत्येक नमूना के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब लेबल.
  2. प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब, CSCL, जीनोमिक डीएनए के 178 μl के 160 मिलीग्राम जोड़ें. ट्यूब CSCL और डीएनए जोड़ने के बाद, ट्यूब के शीर्ष पर एक parafilm का छोटा सा टुकड़ा जगह है और धीरे ट्यूब दस से बीस बार पलटना क्रम में घटकों का मिश्रण है. Pipetting द्वारा मिश्रण मत करो, जो डीएनए के बाल काटना के कारण हो सकता है. अगला, इस ट्यूब के लिए 10 μg / μl EtBr के 10 μl जोड़ने और यह एक ही रास्ते में मिश्रण. (बेहद सतर्क रहो, जब का उपयोग EtBr यह एक ज्ञात उत्परिवर्तजन और संदिग्ध कैसरजन है दस्ताने अक्सर बदलने के लिए और प्रयोगशाला के आराम करने के लिए और आपकी त्वचा के लिए EtBr हस्तांतरण से बचने के लिए सुनिश्चित करें.)
  3. सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों के वजन ऐसी है कि ट्यूबों के बीच मतभेद वजन 1 मिलीग्राम से भी कम कर रहे हैं centrifugation पहले संतुलित कर रहे हैं.
  4. रोटर का उपयोग hemostat में ट्यूबों प्लेस, ढक्कन बंद करें और ultracentrifuge अंदर रोटर जगह.
  5. Ultracentrifuge एक दरवाजा बंद. वैक्यूम के रूप में जल्द ही के रूप में आप दरवाजा बंद से लागू किया जाएगा. 18 घंटे के लिए 1,00,000 rpm और 20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात भागो
  6. जब centrifugation पूरा हो गया है, एक ट्यूब रैक पर hemostat और जगह का उपयोग रोटर से बाहर ट्यूब ले.
  7. नीले प्रकाश transilluminator के साथ डीएनए कल्पना, या अनुपलब्ध अगर, एक अंधेरे कमरे में लंबी तरंगदैर्य यूवी प्रकाश, उपयोग है. एम्बर फिल्टर चश्मे की एक जोड़ी पहनने के लिए डीएनए बैंड को देखने के. चित्र 2 देखें.
  8. एक बाँझ 1cc सिरिंज और सुई (26G 5 / 8) का उपयोग करना, डीएनए बैंड को हटाने और यह एक 1.5ml Eppendorf ट्यूब में जगह.
  9. मदद करने के लिए सिरिंज में मृत अंतरिक्ष में फंसे डीएनए की सबसे पुनर्प्राप्त करने के लिए, 100 μl ते साथ सिरिंज कुल्ला और ट्यूब rinsed समाधान जोड़ने. नमूना प्रति 100 μl ते बफर के साथ एक ट्यूब की तैयारी के क्रम में पार संक्रमण को रोकने.
  10. डीएनए से EtBr हटाने के लिए, ट्यूब को पानी संतृप्त butanol के एक बराबर मात्रा जोड़ने के लिए, और धीरे ट्यूबों दस से बीस बार, 1 मिनट के लिए 10000 rpm पर अपकेंद्रित्र पलटना ऊपर परत त्यागें.
  11. धोने दोहराएँ जब तक butanol का रंग पारदर्शी है, 3 - 4 गुना अधिक है.
  12. जगह एक Amicon अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 मिलीलीटर ते और ऊपर से डीएनए समाधान जोड़ें.
  13. कमरे के तापमान पर 3500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, जब तक डीएनए की मात्रा लगभग 100-500 μl (लगभग 6-7 मिनट) कम है और प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  14. Amicon फिल्टर 2ml ते जोड़ें और 6 मिनट के लिए 3500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, इसके अलावा एक के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए पार संक्रमण से बचने के लिए सुनिश्चित करें. दो बार दोहराएँ.
  15. आवश्यक के रूप में अतिरिक्त centrifugation द्वारा 50-100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए ध्यान और फिल्टर पर एक नया 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब डीएनए समाधान हस्तांतरण.
  16. Amicon फिल्टर करने के लिए 40 μl ते जोड़ें और विंदुक ऊपर और नीचे दोनों फिल्टर झिल्ली के साथ बाहर किसी भी शेष डीएनए धोने. 5.15 में ट्यूब के लिए इस समाधान जोड़ें.
  17. एक Microcon ट्यूब और Microcon prewash में 200 μl autoclaved पानी जोड़ने और 7 मिनट के लिए 10,000 rpm पर centrifuging Microcon YM 30 फिल्टर यूनिट प्लेस.
  18. 5.16 से क्रम में prewashed Microcon डीएनए समाधान जोड़ें आगे डीएनए ध्यान केंद्रित. 3 मिनट - 1 के लिए 5000-10000 जी अपकेंद्रित्र. तरल पदार्थ की राशि की जाँच करेंफिल्टर और दोहराने centrifugation पर जब तक फिल्टर पर तरल की राशि लगभग 50 μl करने के लिए कम है.
  19. फिल्टर यूनिट एक नया Microcon ट्यूब में उल्टा प्लेस और 3 मिनट के लिए जी 1000 में अपकेंद्रित्र. केंद्रित समाधान के आदर्श राशि 50-60 μl है.
  20. उपाय और Nanodrop पर डीएनए की एकाग्रता रिकॉर्ड और चोटी गुणवत्ता की जांच (260nm होना चाहिए).
  21. एक स्वच्छ Eppendorf ट्यूब ऋण में 20 शेयर और स्थिर काम करने के लिए डीएनए के एक छोटे से विभाज्य स्थानांतरण. एक दूसरे स्वच्छ Eppendorf और शून्य से 80 पर फ्रीज करने के लिए डीएनए के बाकी स्थानांतरण.

प्रतिनिधि परिणाम:

जब इस प्रोटोकॉल सही ढंग से किया है, तो आप 4.4 चित्रा 1 के समान डीएनए गुणवत्ता का निर्धारण में कदम के बाद एक जेल छवि देखना चाहिए. वास्तविक डीएनए एकाग्रता के अर्क के नमूने के स्रोत के आधार पर अलग अलग होंगे. CSCL ढाल centrifugation में 5.7 कदम के बाद, नीले प्रकाश द्वारा प्रबुद्ध जीनोमिक डीएनए चित्रा 2 के समान देखना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1 0.8% उच्च आणविक भार subarctic प्रशांत महासागर, (दो प्रतियों में) intercalating एजेंट ethidium ब्रोमाइड (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ दाग में चार गहराई से एकत्र डीएनए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन छवि. जेल 16hrs ~ 15V पर 1X TBE जेल चला बफर में चला गया था. नमूना बैंड अच्छा यांत्रिक कर्तन (एकल बैंड या स्मीयरों के रूप में कई बैंड के विरोध से पता चलता है) के छोटे सबूत दिखा गुणवत्ता के हैं हालांकि 10m अर्क बनाए रखने के कुछ शाही सेना पर ले (0.5 से 2.0 Kb रेंज में स्मियर देखें).

चित्रा 2
चित्रा 2 जीनोमिक डीएनए बैंड CSCL ढाल centrifugation के बाद नीले प्रकाश द्वारा प्रबुद्ध.

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Discussion

कैसे नमूने संसाधित किया जा रहे हैं पर निर्भर करता है, यह एक समय गहन दो एक घंटे ऊष्मायन कदम, और दोहराया washes और centrifugation कदम के कारण प्रक्रिया किया जा सकता है. यह सबसे अच्छा है इस प्रक्रिया के लिए पूरे दो दिन की योजना के लिए बहुत समय छोड़ने के. अगर वहाँ Amicon ट्यूब अंतिम निकालने की मात्रा में हो रही समस्याओं के 200 500μl नीचे डीएनए एकाग्रता और धोने के दौरान, कम अतिरिक्त ते washes और centrifugations करने की कोशिश (भाग तीन दोहराने) उपयुक्त मात्रा तक बचे हुए है. इसके अलावा, अगर निकालने क्लोरोफॉर्म की तीव्रता से बदबू आ रही है, यह सबसे अच्छा है के लिए अतिरिक्त washes जब तक गंध करने के लिए सुनिश्चित करें कि क्लोरोफॉर्म के सभी निकाल दिया जाता है कम है. फिर से, इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता अभिकर्मकों प्रयोगशाला शेयरों से छोटे काम में aliquoted हैं शेयरों यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए अपने डीएनए के नमूने और प्रयोगशाला शेयरों के संदूषण के पार संक्रमण से बचने. इसके अलावा, जब pipetting, हर पार संक्रमण से बचने के लिए इसके अलावा करने के लिए विंदुक युक्तियाँ बदलने के लिए सुनिश्चित करें.

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Acknowledgments

हम तटीय और खुले समुद्र के पानी के कम ऑक्सीजन क्षेत्रों पर चल रहे अध्ययन का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. JJW NSERC और काला कौवा से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया NSERC, किल्लम और तुला माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए वित्त पोषित केंद्र नींव से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था. SL तुला माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए नींव वित्त पोषित केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 cc syringe (26G5/8 needle) BD Biosciences 309597
1 ml syringe (26G5/8 needle) BD Biosciences 309597
1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
15ml tubes Sigma-Aldrich CLS430791
5cc syringe BD Biosciences 309603
Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices EMD Millipore UFC801096 10,000 Nominal molecular weight limit
Butanol Fisher Scientific A383-1 Make it water saturated (butanol:water = 1:1)
Centrifuge rotor, JA5.3 Beckman Coulter Inc. 368690
Centrifuge, Avanti® J-E Beckman Coulter Inc. 369003
Cesium chloride Sigma-Aldrich C4036
Chloroform:IAA (24:1) Sigma-Aldrich 25666-500ML
Ethidium Bromide (EtBr) Sigma-Aldrich E1510-10ml
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Hybridization oven Fisher Scientific 13-247-10 37°C & 55°C
Lysis Buffer 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-5G 125 mg in 1000 μl TE
Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410 50 bp cut off
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) Sigma-Aldrich 77617-500ML
Proteinase K Qiagen 19133
RNase A Fisher Scientific BP2539-100 10 μg/ml
Safe Imager™ Blue light transilluminator Invitrogen S37102
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4509 20% SDS
Sterivex filters Fisher Scientific SVG010RS
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Table top centrifuge Eppendorf 5415D
TE buffer, pH 8.0
Trizma® base Sigma-Aldrich T1503
Ultracentrifuge rotor, TLA 100 Beckman Coulter Inc. 343847
Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) Beckman Coulter Inc. 343775
Ultracentrifuge tube rack Beckman Coulter Inc. 348302
Ultracentrifuge, Optima® Max Beckman Coulter Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15, (3), 187-190 (2004).
  2. Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2, (5), 516-529 (2000).
  3. DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178, (3), 591-599 (1996).
  5. Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55, (3), 548-554 (1989).

Erratum

Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

The step was corrected from:

Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.

to:

Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.

Comments

1 Comment

  1. I am happy to see your method using the sterivex filter, but a little surprised that the references do not include this one: Somerville, C.C., I.T. Knight, W.L. Straube, and R.R. Colwell. 1989. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55: 548-554.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 21, 2010 - 9:20 AM

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