Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). J. Vis. Exp. (2), e157, doi:10.3791/157 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Всего подготовку костного мозга

  1. Четыре B6 мышей забивали и расчлененный получить большеберцовые кости, бедренные кости, бедра и позвоночник.
  2. Во время вскрытия, конечностей и костей находятся в PBS 2% FCS тепла инактивированной (опционально 2 мМ EDA - рассечение среды).
  3. Чистые кости измельчают с ступки и пестика в рассечение среды. Эффективный способ сделать это раздавить большеберцовые кости, бедра и бедра каждой мыши, а затем 2 шипами на время.
  4. Смесь клеток полученных из каждой мыши хранятся отдельно и фильтруют через 40 мкм фильтр в 50 мл трубки сокола. Таким образом, каждая трубка содержит ячейку смесь, полученную из всех ног костей мыши, и половина из полученной смеси с 2 шипами. На данном этапе фильтр используется для разделения кости мусора.
  5. Как правило, рекомендуется сокрушить кости ног дважды, чтобы получить белый (без костного мозга) костных фрагментов, а также фрагменты позвоночника 2 или 3 раза.
  6. Заполнение трубы, чтобы они сбалансированы, и спина 5 1200rpm мин.
  7. Аспирируйте супернатант и ослабить гранул путем перетаскивания труб на трубе стойки (этот шаг важен после каждого центрифугирования, чтобы минимизировать образование скопления и клеточных потерь). Ресуспендируют каждой трубки в 1 мл PBS 2% FCS (NO ЭДТА с сегодняшнего дня), если вы делаете линии истощения, или в любом объеме иным удобным для Вас.

Lineage истощения

  1. Эта процедура позволяет устранить высоко дифференцированные клетки и получить очень гетерогенной популяции клеток, обогащенные для стволовых и прогениторных клеток. Если вы сортировки HSC, этот шаг существенно сокращает количество ячеек, которые должны пройти через сортировки клеток, тем самым уменьшая время сортировки и позволяет Вам сортировать HSC из большего количества мышей, так что вы можете получить большее количество HSC в одном сортировки.
  2. Если вы собираетесь для сортировки позже, вывезти 50 мкл клеточной смеси (обычно я взять немного из каждой пробирки) для сортировки элементов управления (неокрашенные и SCA1, с-Kit, CD48, Flk2 одного управления цветом).
  3. Добавить Лин коктейль 30ml/tube. Lineage коктейль содержит различные антитела, которые, к сожалению немного меняется из лаборатории в лабораторию. В лаборатории Скадден, мы используем biotinilated антител против Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Их окончательное растворение в окрашивание 1:700.
  4. Vortex быстро перемешать, и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° C.
  5. Во время инкубации, подготовить колонн на магниты и 15 мл пробирки элюирования под колоннами. Дега некоторые PBS использованием steriflip фильтр (вы увидите маленькие пузырьки воздуха движется к поверхности PBS за счет вакуум-аспирация), и равновесие колонн с применением 3 мл дегазированной PBS для каждого столбца.
  6. Колонке потока составляет около 1ml/5min, поэтому она занимает около 15 минут, чтобы колонны готовы к использованию.
  7. В конце инкубации, добавьте PBS 2% FCS для заполнения трубы и со спином вниз в течение 5 мин при 1200rpm.
  8. Аспирируйте супернатант, ослабьте окатышей и ресуспендируют в 1 мл / труба дегазированной PBS.
  9. Если вы сортировка позже, вывезти общего костного мозга Lineage один цвет окрашивания Ctrl (15 мл, немного из каждой пробирки).
  10. Добавить стрептавидин 30ml/tube бусы, вихрь быстро перемешать, и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° C.
  11. В конце инкубации, добавьте 2 мл / трубка дегазированной PBS. Положите новую коллекцию под трубы колонны, и применять каждый подвески на колонку, фильтрации через 40 мкм фильтр.
  12. Добавьте еще 3 мл дегазированной PBS в каждую пробирку, чтобы вымыть его. Как только столбцы пусты, применяется еще раз, используя те же 40 мкм фильтр.
  13. Элюат содержит линии обедненного ячейки смеси, обогащенные гетерогенной популяции стволовых клетках и прародителей. Бассейн содержание 4 трубы на 2 трубки. Спиновые в течение 5 мин при 1500 об.
  14. Аспирируйте супернатант. Осадок должен быть белым или в основном белые. Ослабить окатышей и ресуспендирования их вместе в 1 мл PBS общая 2% FCS, если вы сортировка позже, в противном случае ресуспендируют в любом объеме удобно для вас.

ЛКС или долгосрочной сортировки HSC

  1. Выньте линии обедненного один цвет окрашивания Ctrl (15 мл). Это позволит вам оценить эффективность вашей линии истощения.
  2. Смесь клеток для сортировки окрашивается в 15 мл трубки.

Добавить антител:

Sca PE-Cy5.5 1: 100 10мл
Комплект APC 1:100 10мл
С. А. PE-Cy7 1:500 2 мл

Для сортировки долгосрочных HSC, а также добавить:

CD48 FITC 1:1000 1 мл
Flk2 PE 1:200 5 мл

Кроме того, подготовить единый окрашивания элементов управления с помощью общего костного мозга хранятся в сторону после вскрытия и общий костного мозга происхождение пятна. Эти окрашивания может быть сделано непосредственно в пробирки СУИМ.

Убедитесь в том, чтобы в темноте!

  1. Vortex быстро перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 до 30 минут, повторное смешивание полпути.
  2. Чтобы смыть избыток антител, заполнить трубы с PBS 2% FCS и спина в течение 5 мин при 1500 оборотах в минуту.
  3. Удалить супернатант, ресуспендируют все гранулы и переместить их в новых трубах FACS с фильтром шапки. Это может занять некоторое время, чтобы клетки, чтобы пройти через эти фильтры, и очень важно, чтобы применить некоторые более PBS потом мыть фильтр и свести к минимуму потерю клеток. Этот шаг необходим, чтобы избежать засорения сортировщик, который является самым страшным кошмаром каждого пользователя сортировщика клеток.
  4. Когда раздавать ваши клетки на объект сортировки клетки, не забудьте также подготовить трубку с PBS 10% HI ФТС, где клетки будут собраны.
  5. Если вы сортировки ЛКС клетки, вы получите гетерогенной популяции содержащие долгосрочные и краткосрочные заселения HSC и мультипотентных предшественников. Средняя урожайность составляет 300000 ЛКС из 4 мышей.
  6. Если у вас есть также используется CD48 и Flk2 антител, можно разделить каждой популяции долгосрочных HSC, короткая HSC срок и MPP. LT-HSC являются наиболее редкими населения. Средняя урожайность составляет около 50000 до 60000 от 4 клетки мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

9 Comments

  1. Hi, Thankyou for the wondeful post. I was working with endothelial progenitor cells and wanted to know how many of the bone marrow cells are Sca-1 positive. Also is it possible that we can extract the BMC and then store them at -²0 and stain them for FACS the next day? Any help will be greatly appreciated. Thanks 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2008 - 1:45 PM
  2. You can sort on the following day, but you should keep the cells at 4C, better in an ice bucket in the fridge. Many cells die upon freezing

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:25 AM
  3. Can you please tell me where you purchased your streptavidin beads? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 2, 2008 - 12:33 PM
  4. miltenyi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 AM
  5. How do you isolate muscle tissue from spin bone? And if without specific step to isolate muscle tissue, would the results of FACS be different? BTW. How do you deleption RBC form those bone marrows? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2008 - 4:20 AM
  6. you need to use a scalpel and much patience. LEaving muchmuscle around the spine makes it harder to crush and will reduce your yield.   RBC are depleted while lineage depleting. The post-column pellet is white. I do no recommend a separate RBC lysis because there is the risk it will damage other cells also.Moreover, it is hard to perform it consistently.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:29 AM
  7. How many HSCs do you inject into the irradiated recipients?

    Reply
    Posted by: Wilma J.
    August 20, 2010 - 11:39 AM
  8. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM
  9. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics